Деградация белков и пептидов в цитоплазме.

 

                  Селекция белков и  последующий протеолиз осуществляется в цитоплазме сложной многокомпонентной системой. В этих принимают участие олигопептид убиквитин и убиквитиновая система, АТФ и полиферментный комплекс, называемый протеасомой, который кроме протеолитической активности обладает еще и АТФ-азной активностью, а также шапероны, специфические белки, контролирующие  свертывание (фолдинг) полипептидных цепей, их миграцию и протеолиз.

 

                                               Убиктивин и убиктивиновая система протеолиза.

 

                В последнее десятилетие получены убедительные свидетельства о том, что протеолитический путь деградации многих внутриклеточных белков, найденных в цитоплазме зависит от убиквитина – пептида, состоящего из 76 аминокислотных остатков с молекулярной массой  8600 Da. Убиквитин присутствует во всех клетках эукариот, при этом его структура отличается поразительной консервативностью, что свидетельствует в пользу широкого распространения убиквитин-зависимого протеолиза.

                В целом роль убиквитина выглядит так. Между убиквитином и белком-субстратом образуется ковалентная связь, возникающая между ε-аминными группами остатков лизина белка и карбоксильной группой концевого остатка убиквитина. Образовавшиеся конъюгаты, которые содержат более чем одну молекулу убиквитина, могут быть  деградированы протеиназами, в основном протеасомами. Узнавание белков, подлежащих протеолизу осуществляется так называемым  убиктивиновым комплексом, способным взаимодействовать с отработанными или аномальными белками. АТФ расходуется как на стадии образования, так и на стадии деградации конъюгатов убиквитина с белком. Есть основания полагать, что убиквитин вызывает значительные конформационные изменения субстратного белка, что делает этот белок чувствительным к протеолизу. Связывание белка с убиквитином служит сигналом для «узнавания» этого белка протеиназами, что обеспечивает механизм избирательной деградации внутриклеточных белков.

                Главный вопрос заключается в том, какие особенности белковых молекул служат сигналом для их конъюгации с убиквитином и в конечном итоге для деградации. Безусловно, крайне важна генетическая основа, обеспечивающая специфическую структуру белков и позволяющая узнавать их как субстраты протеолиза. Однако, целый ряд белков может быть узнан благодаря вторичным сигналам, которые появляются в результате посттрансляционных модификаций. К основным первичным и вторичным сигналам для присоединения убиквитина могут быть отнесены следующие:

 конформация N-терминальной области пептида, в частности    наличие «дестабилизирующей» N-концевой или другой свободной

-аминогруппы («N-концевое правило») или специфически расположенный лизин субстрата;

 определенные короткие мотивы в последовательности аминокислотных остатков (а не трехмерная структура целой молекулы белка);

 нарушения вторичной структуры белка (неправильное свертывание) полипептидной цепи;

 повреждение боковых цепей остатков аминокислот, в том числе их окисление (например окисление остатков метионина);

 избыточное гликозилирование белков и пептидов.

                Имеются основания полагать, что убиквитин-зависимые протеиназы принимают участие в процессах деградации белков и пептидов с аномальной структурой, что является определяющим фактором адаптации клетки к изменяющимся условиям. Кроме того известно что, деградация коротко-живущих регуляторных белков через  убиквитин-протеасомный путь играет важную роль в основополагающих процессах клетки. К таким белкам, например, относятся циклины, циклин-зависимые киназы и их ингибитры, супрессоры опухолей, онкобелки, активаторы транскрипции и их ингибиторы и многие другие. Весьма детально изучена деградация циклинов – регуляторных белков, которые синтезируются и затем быстро разрушаются на различных фазах клеточного цикла, контролируя тем самым прогрессию этого процесса.

                Итак, селекция белков для деградации может определяться первичными (конститутивными) или вторичными, (посттрансляционная модификация или ассоциирование с вспомогательными белками) сигналами. Именно эти сигналы узнаются специфическими убиквитин-белок лигазами, с которами субстратные белки связываются перед убиквитинированием. Поэтому эти лигазы являются ключевыми факторами в убиквитиновом протеолитическом каскаде: «узнают» белок для связывания, который подвергнется последующей деградации. Таким образом, катаболизм белка убиквитиновой системой осуществляется в два основных дискретных этапа: (1) ковалентное связывание множества молекул убиквитина с субстратным белком и (2) деградация меченного субстрата. Схема, отражающая последовательность событий убиквитинового пути деградации белков приведена на рис 1.

               Роль АТФ в действии гидролазы и интеграции протеиназы убиквитин-С терминальной гидролазой комплекса 26S остается не ясной. Недостаточно расшифрованы и другие стадии убиквитинового протеолиза, хотя главные биохимические события основных его этапов изучены и понятны. Уже очевидно, что модификация убиквитином различных регуляторных белков-мишений с последующей деградацией играет существенную роль в регуляции генной экспрессии клеточного цикла и деления клетки, в ответе клетки на стресс, в модификации рецепторов на поверхности клетки, в ДНК репарации, в апоптозе, в биогенезе митохондрий и рибосом, а также удалении аномальных и мутантных короткоживущих белков. В этом случае модифицированные множеством убиквитина белки являются мишенями для протеолиза специфическими протеиназами. Кроме того, стабильные моноубиквитиновые производные белков обнаружены во внеклеточном пространстве, например, гистоны нуклеосом.

Несмотря на значительный прогресс в выяснении механизмов действия и роли убиквитиновой системы, многие проблемы остаются неразрешенными. Например, мало известно о природе  структурных сигналов, которые «метят» белки для связывания и последующей деградации. Как уже было упомянуто выше, некоторые  N-концевые остатки аминокислот могут служить маркерными сигналами для убиквитин-связывающего фермента. Однако, большинство клеточных белков N-α-ацелировано, а  среди остальных белков со свободными N-концевыми остатками аминокислот, «дестабилизирующие» остатки крайне редки. В последние годы было показано, что   N-α-ацелированные белки деградируются убиквитиновой системой и что их деградация требует специфицеских белковых факторов, которые не участвуют в деградации белков со свободной N-концевой аминокислотой. Один из таких факторов оказался идентичен фактору элонгации EF-1α синтеза белка. Идентичность этих факторов, вовлеченных в процессы как синтеза, так и деградации белка, свидетельствует об общности регуляторных механизмов между этими двумя процессами.

                Не решены проблемы физиологической роли  убиквитиновой системы в ее возможной ассоциации с другими протеолитическими системами клетки, которые скорее всего являются весьма тесными, как это можно заключить на основании интенсивных исследований последних лет. Так, например,  уже стало известно, что индуцированная стрессом лизосомная деградация клеточных белков требует убиквитин-активирующего фермента Е1.

 

АТФ-зависимый протеолиз.

 

                Зависимость протеолиза от АТФ была обнаружена 25 лет тому назад, когда было показано, что недостаток АТФ способен оказывать тормозящее действие на внутриклеточный распад белков.                 Как АТФ участвует в деградации белков еще мало известно. В наибольшей степени изучены АТФ-зависимая протеолитическая активность, присущая растворимой фракции ретикулоцитов. По-видимому, она ответственна за избирательную деградацию аномальных белков в клетке, а также за утрату органелл в процессе созревания ретикулоцитов. Потеря этой активности в стареющих эритроцитах приводит к накоплению токсических окисленных и денатурированных белков, что, в свою очередь, отражается на продолжительности жизни клеток.

                Есть основания полагать, что использование АТФ протеиназами зависимыми от АТФ сходно с использованием этого нуклеотида другими молекулярными соединениями. Гидролиз АТФ может сопровождать:

 реакции  рефолдирования и дефолдирования полипептидных цепей, что делает их более доступными для протеолиза;

 транслокацию белковых субстратов к протеолитическим активным центрам протеасом;

 повышение эффективности связывания белков-субстратов с протеиназами, поскольку начальное взаимодействие между субстратом и ферментом осуществляется кинетическим механизмом «пробного считывания» для отбора только подходящих для протеолиза субстратов.

                АТФ-зависимым, как это было видно из предыдущего раздела, является убиквитиновый путь деградации белка. АТФ вовлекается в этот путь протеолиза, по крайней мере в трех независимых процессах:

 ковалентное связывание убиквитина с белком-мишенью – гидролиз АТФ требуется для активации убиквитина ферментом Е1;

 формирование ансамбля 26S протеасомного комплекса, молекулярные механизмы которого еще  до конца не известны;

 гидролиз связанных с убиквитином белков с участием 26S протеасом и освобождение убиквитина.

                Эта утилизация метаболической энергии на основных этапах деградации белков подтверждает физиологическую возможность участия протеасомной убиквитин-зависимой протеолитической системы в  селективном удалении «ненужных» и отработанных короткоживущих и быстрообновляемых белков, а также аномальных белков генерируемых в клетках. Следует заметить, что расщепление белков в интактных клетках требует значительных затрат энергии. Так, например, расход АТФ при протеолизе белков митохондрий в убиквитин-зависимой протеолитической системе достигает по меньшей мере одной молекулы АТФ на каждую расщепленную пептидную связь. Выявлены АТФ-зависимые протеиназы, осуществляющие регуляцию уровня внутриклеточного протеолиза без участия убиквитина. Итак, можно заключить что, АТФ-зависимые протеиназы играют ключевую роль в процессе регуляции внутриклеточного уровня белков и пептидов.