microbio_zool

13

Раздел II. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Занятие № 3

Тема: Питательные среды. Выделение чистых культур бактерий (I этап). Цель занятия: Изучить состав питательных сред, их классификацию, требования, предъявляемые к питательным средам. Освоить методы выделения чистых культур. Провести I этап выделения чистой культуры микроорганизмов из смыва вымени коровы.

Материалы и оборудование: Набор ингредиентов для приготовления питательных сред, готовые питательные среды, микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, дистиллированная вода, растворы красок, этиловый спирт 96%-ный, пробирки с микробными культурами, иммерсионное масло, фильтровальная бумага.

Вопросы для обсуждения:

1.Питательные среды, их приготовление.

2.Основные типы сред, классификация.

3.Требования, предъявляемые к питательным средам.

4.Накопительные культуры и принцип элективности.

5.Микробные ассоциации (микробиоценозы).

6.Методы посева: штрихом, уколом, шпателем, тампоном.

7.Методы выделения чистых культур аэробных бактерий:

-метод механического разобщения

-биологический метод

-методы физического воздействия

-методы химического воздействия

I. Питательные среды

Питательные среды это субстраты для питания микроорганизмов, применяемые в микробиологической практике для выращивания микроорганизмов в лабораторных или производственных условиях и выделения чистых культур (штаммов микроорганизмов). Чистая культура это популяция микроорганизмов одного вида, выросшая на питательной среде. Штамм – это чистая культура микроорганизмов, выделенная из того или иного источника. Культуры одного вида, выделенные из разных источников или из одного источника в разное время, считаются разными штаммами и могут отличаться друг от друга по свойствам.

14

Классификация питательных сред

По физическим свойст-		По составу		По назначению
вам
1. жидкие – МПБ, 1%	1.	простые	1.	общие (универсальные) МПБ, МПА
пептонная вода
2. полужидкие полу-	2.	сложные	2.	элективные солевые, щелочной
жидкий МПА (концен-	КАА		природы
трация агара до 1%)
3. плотные – МПА (кон-	3.	синтетиче-	4.	дифференциально-диагностические
центрация агара 2 3 %)	ские Сотона		Эндо, Олькеницкого, цветной ряд Гисса
			5.	консервирующие – тиоглюколиевая,
			глицериновая

Требования, предъявляемые к питательным средам:

должны быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для метаболизма;

должны иметь оптимальную рН, так как концентрация ионов водорода влияет на проницаемость оболочки. Для большинства патогенных микроорганизмов оптимальна слабощелочная среда, за исключением: холерного вибриона (рН 8.5 9.0), туберкулезной палочки (рН

6.2 6.8), грибов р.Candida (рН 6.2 6.8);

должны обладать буферностью содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена;

должны быть изотоничными для микробной клетки осмотическое давление в среде должно соответствовать давлению внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимум составляет 0.5% NaCl;

среды должны быть стерильными и прозрачными; плотные среды должны быть влажными и иметь необходимую конси-

стенцию; среды должны иметь определенный окислительно-восстановительный

потенциал (r H2), который показывает насыщение среды кислородом. Аэробные микроорганизмы имеют высокий окислительновосстановительный потенциал, а анаэробные низкий;

среды должны быть унифицироваными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Например: для патогенных энтеробактерий содержание аминного азота составляет 0.8 – 1.2 г/л, для диф-

терии – 2.5 3.0 г/л.

15

II. Накопительные культуры, принцип элективности. Методы выделения чистых культур

Накопительной называют культуру, в которой преобладают представители одной физиологической группы или одного вида микроорганизмов. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологических исследований С.Н.Виноградским и М.Бейеринком. Сущность его заключается в создании элективных, т.е. избирательных условий, которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых микроорганизмов или группы микроорганизмов из смешанной популяции.

При создании элективных условий учитывается физиология выделяемых микроорганизмов: источник питания; отношение к аэрации, температуре, кислотности среды; способность к образованию эндоспор. О получении накопительной культуры судят по появлению характерных признаков развития выделяемых микроорганизмов: помутнение среды, иногда сопровождаемое пигментацией; появление пленки, осадка; выделение газа.

В природных условиях и в макроорганизме микробы находятся в ассоциациях. Для выделения необходимого микроорганизма в чистую культуру используют несколько методов:

1.Метод механического разобщения микроорганизмов представляет со-

бой разобщение при посеве для получения изолированных колоний (посев штрихом петлей; метод "петли-дорожки"; метод Дригальского (рис. 1); метод серийных разведений).

2.Биологический метод выделения чистой культуры заключается в том,

что патологическим материалом заражается чувствительное к определенному виду микроорганизма экспериментальное животное. После его гибели микроб обнаруживается в мазках-отпечатках из органов при микроскопии, а также при посевах из органов на среды.

3.Метод физического воздействия предполагает физическое отделение микробов друг от друга при посеве. Например: метод термического воздействия при отделении споровых культур от неспоровых или использование ультрафиолетового облучения.

4.При химическом методе используют свойство устойчивости микроорганизмов к кислотам, спиртам и щелочам. Культивирование проводят на элективных средах: для стафилококка добавляют 15%-ный NaCl, для холерного вибриона – OH . Химическими веществами можно подействовать на исследуемый материал, например: на мокроту больного с поозрением на туберкулез действуют 10 %-ной H2SO4, микобактерии ту-

16
беркулеза кислотоустойчивы, а	все	остальные	микробные
формы погибают.

Рис. 1. Посев микроорганизмов на поверхность плотной среды: а – шпатель Дригальского; б – положение чашки и руки при посеве шпателем; в – рост микроорганизмов после рассева шпателем; г – рост микроорганизмов после рассева петлей

Ход работы:

I.Изучить набор ингредиентов для приготовления питательных сред: агар-агар, пептон, мясные кубики, желатин.

II.Изучить набор концентратов для приготовления сред: а) сухие полуфабрикаты, б) гидролизат рыбный.

III.Изучить готовые питательные среды.

IV. Выделить чистую культуру аэробов (I этап):

	17
Приготовить препарат из	смыва вымени коровы,
окрасить по Граму;

Выявить различных по морфологии бактерий в изучаемой микробной ассоциации (смыв вымени) и зарисовать.

V. Выделить чистую культуру методом механического разобщения:

Произвести посев из смыва вымени коровы на чашку Петри с МПА методом Дригальского;

Произвести посев из смыва вымени коровы на чашку Петри с

МПА методом "штриха".

VI. Выделение чистой культуры химическим методом (разбор). VII. Выделение чистой культуры биологическим методом (разбор).

VIII. Выделить чистую споровую культуру из смеси СТИ (вакцинальный штамм) физическим путем (кипячением) и неспоровую культуру (протея) методом Шукевича:

Приготовить препарат из смеси бактерий № 2, окрасить по Граму и промикроскопировать. Отметить наличие крупных ГР(+) палочек (подозрение на споровую культуру) и мелких полиморфных ГР(-) палочек (подозрение на культуру протея), зарисовать;

Произвести посев исследуемой смеси № 2 для выделения чистой культуры Proteus vulgaris методом Шукевича на скошенный МПА (сеять только в конденсационную воду!);

Смесь № 2 прокипятить 5–10 минут и штрихом посеять на МПА. IX. Все посевы подписать и поставить в термостат при 37 о С на 24 часа. X. Результаты исследований занести в протокол.

Тесты для проверки знаний:

1.Элективные среды: а) МПА, б) кровяной агар, в) щелочной агар,

г) солевой агар.

Ответ: в, г

2.Вещества, необходимые для роста микроорганизмов: а) аминокислоты, б) индикаторы, в) витамины, г) ферменты, д) микроэлементы.

Ответ: а, в, д

Ключевые слова: питательные среды, накопительные культуры, элективность, чистая культура, микробные ассоциации (микробиоценозы), штамм

18

Занятие № 4

Тема: Ферменты бактерий. Выделение чистых культур бактерий (II и III этапы). Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, УФО и химическим веществам. Культивирование анаэробов.

Цель занятия: Произвести учет I этапа выделения чистой культуры, изучить культуральные свойства и морфологию колоний. Освоить методы культивирования анаэробов. Провести II и III этапы выделения чистой культуры микроорганизмов из смыва вымени коровы. Сделать посевы для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, УФО и химическим веществам.

Материалы и оборудование: Набор бумажных индикаторных дисков, сулема, фенол, предметные стекла, бактериологическая петля, дистиллированная вода, растворы красок, этиловый спирт 96%, посевы с чистыми культурами (I этап), иммерсионное масло, фильтровальная бумага.

Демонстрация:

1.Аппаратура для культивирования анаэробов (насос Камовского, анаэростат, эксикатор).

2.Рост анаэробов (по Фортнеру, в среде Китт-Тароцци, в молоке, в высо-

ком столбике). Вопросы для обсуждения:

1.Классификация антибиотиков, механизм действия.

2.Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

3.Ферментативные свойства бактерий – протеолитические, гликолитические, окислительно-восстановительные ферменты, ферменты агрессии. Методы их обнаружения.

4.Систематика микроорганизмов.

5.Культуральные свойства микроорганизмов.

6.Влияние физических и химических факторов на микроорганизмы.

7.Классификация бактерий по типам дыхания. Сущность процесса дыхания у микробов.

8.Культивирование анаэробов.

	19
I. Антибиотики. Методы	определения чувствительности

микроорганизмов к антибиотикам

Антибиотики – химиотерапевтические вещества микробного, полусинтетического или синтетического происхождения. В малых концентрациях вызывают гибель или торможение размножения чувствительных к ним микроорганизмов и опухолевых клеток.

При определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используют следующие методы:

1.Метод «бумажных дисков». При использовании этого метода признаком антибактериальной активности антибиотиков является определение зоны роста культуры на МПА вокруг диска, пропитанного антибиотиком. При наложении диска на среду антибиотики растворяются влагой среды и диффундируют в окружающую среду. В зависимости от активности антибиотиков площадь задержки роста микроорганизмов различна.

2.Метод серийных разведений (пробирочный вариант). Позволяет опре-

делить действующую концентрацию антибиотика. Учет опыта проводится по последней пробирке, где наблюдается задержка роста микробной культуры.

II.Классификация ферментов

Гидролазы		Индуцибельные
Оксидоредуктазы	Экзоферменты	Конститутивные
Трансферазы	Эндоферменты
Лиазы
Изомеразы
Лигазы

III. Культивирование анаэробов

		20
К	анаэробам	относят микроорганизмы,	которые

существуют в бескислородных условиях. Различают: а) строгие (облигатные) анаэробы палочка столбняка, ботулизма; б) факультативные анаэробы, которые размножаются при ограниченном доступе кислорода и в анаэробных условиях (кишечная палочка). Аэробы вырастают на поверхности столбика; рост анаэробов происходит в глубоких слоях среды. Факультативные анаэробы растут как на поверхности среды, так и в глубине.

Существует несколько методов создания анаэробных условий.

1.Применяемые для культивирования анаэробов питательные среды подвергаются перед засевом регенерированию, т.е. освобождению от растворенного кислорода химическим или физическим методом. Обогатительной средой для анаэробов является среда Китт–Тароцци, которая состоит из мясо-пептонного бульона с 0.5% глюкозы и кусочками паренхиматозных органов на дне пробирки в качестве редуцирующего вещества; сверху среда заливается слоем вазелинового масла для механического разобщения воздухом. Для культивирования анаэробов часто пользуются средой Вильсон–Блера. Среда Вильсон–Блера состоит из МПА, глюкозы, раствора сульфита натрия и раствора хлорного железа. Отнятый от глюкозы в процессе анаэробного дыхания водород восстанавливает сульфит натрия в сернистый натрий, а последний реагирует с хлорным железом и образует сернистое железо, которое окрашивает колонии в черный цвет.

2.Воздух из среды удаляют механическим путем. Для этого используют анаэростаты, из которых воздух выкачивается насосом.

3.Замена воздуха индифферентным газом, например водородом, который получается в аппарате Киппа и через присоединенную трубку поступает в сосуд, где помещены посевы анаэробов, вытесняя кислород.

4.Механическая защита от кислорода воздуха используется с применением способа Виньяль–Вейона. Для этого берут стеклянную трубку и один из ее концов вытягивают в капилляр, а у другого делают перетяжку и вставляют ватную пробку, засевают в растопленный агар исследуемый материал, перемешивают среду и затем насасывают агар в стерильную трубку. Затем запаивают капилляр и трубку помещают в термостат. В среде вырастают колонии бактерий, которые можно извлечь, распилив трубку.

21

5.Химическое поглощение кислорода воздуха, например щелочным раствором пирогаллола (10%-ный раствор щелочи и пирогаллола) в особых пробирках (способ Бюхнера).

6.Биологический метод – комбинированный посев культур анаэробов и аэробов (способ Фортнера). Посев производят на чашку Петри с толстым слоем кровяного агара, разделенного пополам вырезанной в середине чашки прокаленным стерильным скальпелем небольшой полоски агара. На одной половине агара делают посев культуры аэроба, например Bac.prodigiosum, а на другой – анаэроба, чашку обмазывают парафином и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробов; когда же они исчерпают из чашки в достаточной мере кислород, начинается рост анаэробов.

Ход работы:

I.Изучить культуральные свойства, описать морфологию колоний.

Просмотреть чашки, засеянные на предыдущем занятии. Отметить на поверхности среды наличие отдельных колоний;

Изучить морфологические особенности строения отдельных колоний:

1)величину (крупная – 4–5 мм в диаметре, средняя –2–4 мм, мелкая – 1–2 мм, карликовая – меньше 1 мм);

2)форму очертания колонии (правильно и неправильно круглая, розеткообразная, ризоидная и др.);

3)степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная);

4)цвет колонии (бесцветная, пигментированная);

5)поверхность (гладкая, шероховатая, блестящая, влажная или морщинистая, матовая, сухая, с радиальной или концентрической исчерченностью);

6)положение колонии на питательной среде (плоская, выпуклая, с вдавлением);

7)консистенция (плотная, сухая, слизистая, мажущаяся, тянущаяся и др.). Консистенция определяется петлей во время взятия материала колонии для приготовления мазка.

II.Изучить колонии под микроскопом. Для этого установить чашку Петри вверх дном на предметном столике микроскопа, опустить конденсор, осветить поле зрения зеркалом и установить объектив 8. Изучить структуру и края и колонии:

22

1)характер края колонии (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые, фестончатые);

2)структура колонии (гомогенная, зернистая, волокнистая и др.).

III.Из части изученной колонии приготовить мазок, окрасить по Граму, промикроскопировать и убедиться в наличии однотипных бактерий.

IV.При наличии однотипных бактерий оставшуюся часть колонии (смесь № 1) засеять петлей штрихом на поверхность скошенного МПА для получения чистой культуры и поместить в термостат.

V.Изучить биохимические свойства бактерий. Сделать посевы для:

определения протеолитических ферментов;

обнаружения продуктов метаболизма: индола, H2S, NH3;

определения гликолитических ферментов.

VI. Провести III этап выделения чистой культуры:

Визуально отметить характер роста выделенной культуры на скошенном агаре (цвет, прозрачность, однородность);

Приготовить препарат, окрасить по Граму и промикроскопировать. Убедиться в чистоте выделенной культуры;

Определить семейство и род выделенной чистой культуры по "Определителю бактерий" Берги: 1) пользуясь "ключом" определителя (стр.

24 25), установить часть определителя; 2) пользуясь "ключом" соответствующей части, определить семейство бактерий; 3) пользуясь "определителем", сделать посевы чистой культуры для последующего определения рода выделенной культуры бактерий.

VII. Сделать посевы для определения чувствительности к антибиотикам, УФО и химическим веществам.

VIII. Результаты исследований занести в протокол в виде таблицы:

Морфологические свойства		Культуральные свойства
Форма, расположение спор	Величина	Форма	Цвет	Край		Консистенция

Тесты для проверки знаний:

1.По наличию субстрата ферменты классифицируются на: а) экзоферменты, б) индуцибельные, в) конститутивные, г) эндоферменты.

Ответ: а, г