microbio_zool

43

чувствительностью, находят широкое применение в экспресс-диагностике бактерий, грибов, вирусных инфекций.

7. Реакции иммунофлюоресценции (РИФ) основаны на использовании флюорохромов, коньюгированных с Ат (рис. 6). При этом Ат сохранили способность взаимодействовать со строго определенными Аг. Комплексы Аг (в виде клетки) с меченым Ат можно легко определить по интенсивному желто-зеленому свечению в УФ лучах люминесцентного микроскопа. РИФ могут быть поставлены в несколько вариантах:

1.Прямая РИФ - предполагает применение люминесцирующей сыворотки против каждого изучаемого Аг (сибироязвенная люминесцирующая сыворотка, бруцилезная люминесцирующая сыворотка, и т.д.).

2.Непрямая РИФ - основана на использовании двух различных антисывороток. Вначале к фиксированному на стекле Аг прибавляют немеченые Ат против изучаемого Аг, препарат промывают и на II этапе реакции

образовавшийся комплекс Аг Ат обрабатывают люминесцирующей сывороткой, содержащей меченые флюорохромом Ат к Jg того животного, чья сыворотка была использована на первом этапе. Непрямой РИФ можно выявить как Ат, так и Аг в исследуемой сыворотке больного животного.

Рис. 6. Схема иммунофлюоресценции (метод Кунса): А прямой вариант; Б непрямой вариант; Аг – антиген, Ат – антитело, АГС – антиглобулиновая сыворотка.

44

8. Реакция энзиммеченых антител (РЭМА), или иммуноферментный анализ (ИФА) основана на использовании в качестве метки Ат ферментов, способных разлагать субстрат с образованием окрашенных продуктов. В качестве фермента часто используется пероксидаза хрена, а в качестве субстрата для нее ортофенилендиамин, 5 аминосалициловая кислота и другие вещества. Существует много методических вариантов ИФА: прямой, непрямой, двойной, конкурентный. По ферменту судят об образовании иммунного комплекса Аг Ат, одно из которых было неизвестно.

Ход работы:

I. Поставить пластинчатую агглютинацию.

II.Учесть по готовому ряду развернутую реакцию агглютинации. Определить титр антител в сыворотке.

III. Учесть РНГА. Сделать выводы. Зарисовать.

IV. Поставить реакцию кольцепреципитации:

В 3 пробирки налить по 1 мл сыворотки: в 1-ю - сибироязвенную преципитирующую сыворотку, во 2-ю - туляримийную преципитирующую сыворотку, в 3-ю - нормальную сыворотку (АТ нет);

Во все пробирки наслоить постепенно на сыворотку 1 мл испытуемого экстракта;

Учесть реакцию, сделать выводы, зарисовать;

V. Учесть реакцию преципитации по Манчини и Оухтерлони. Сделать выводы. Зарисовать.

VI. Учесть реакцию ИФА. Сделать выводы. VII. Результаты работы занести в протокол.

Тесты для проверки знаний:

1. Для реакции агглютинации берут: а) живые клетки бактерий, б) убитые клетки бактерий, в)лизат из клеток, г) токсины бактерий, д) ферменты бактерий. Ответ: а, б

2. Для реакции преципитации в качестве Аг используют: а) убитые клетки бактерий, б) лизаты бактерий, в) экзотоксины бактерий, г) молекулярные вещества. Ответ: б, в, г

Ключевые слова: антиген, антитело, серологические реакции, диагностикум, сыворотка, флюорохром

45

Занятие № 9

Тема: Методы лабораторной диагностики инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, вызываемых бактериями.

Цель занятия: Познакомить с методами лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

Материалы и оборудование: Фиксированные мазки возбудителя туберкулеза, бруцелеза, сибирской язвы; набор красок. Чашки Петри с ростом на МПА, вакцинированные штаммом сибирской язвы СТИ и чумы. Среды Гисса с ростом; чистые культуры E.coli; агглютинирующие сыворотки (коли и сальмонеллезная); испытуемый экстракт на сибиреязвенный Аг; преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, нормальная сыворотка, кровь цыпленка с подозрением на пуллороз, пуллорозный антиген для РА. Демонстрация:

1.Планшет с ИФА на пастереллез (экспресс-диагностика).

2.Развернутая РА (серодиагностика бруцеллеза). Вопросы для обсуждения:

1.Факторы вирулентности у бактерий.

2.Клеточные структуры бактерий, играющие роль в возникновении инфекционного процесса. Методы их выявления.

3.Антигенная структура бактерий.

4.Бактериоскопический метод диагностики инфекционных болезней.

5.Бактериологический метод диагностики инфекционных болезней.

6.Биологический метод диагностики инфекционных болезней.

7.Серологический метод диагностики инфекционных болезней.

8.Аллергический метод диагностики инфекционных болезней.

9.Экспресс-диагностика инфекционных заболеваний.

I. Методы изучения инфекционных болезней

сельскохозяйственных животных

В микробиологической диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных применяют следующие основные методы исследования:

1. Бактериоскопический (микроскопический) метод.

Из исследуемого материала больного животного (гной, раневое отделяемое, мокрота и т.д.) делают мазок, красят по Граму или другим методом и под микроскопом выявляют возбудителя. Так можно диагностировать туберкулез, сибирскую язву, чуму и другие инфекции.

46

2. Бактериологический метод.

Из материала больного животного выделяют чистую культуру на питательных средах и изучают ее свойства: морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие.

3. Биологический метод.

С помощью этого метода выделяют чистую культуру возбудителя через лабораторных животных (кролика, морскую свинку и т.д.).

4. Серологический метод.

Обнаружение с помощью серологических реакций (РА, РП, РИФ, ИФА и др.) специфических Ат в сыворотке крови больных животных. Особое значение метод приобретает для диагностики тех заболеваний, возбудителей которых выделить трудно, или при хронических инфекциях.

5. Метод кожных аллергических проб.

Метод основан на выявлении гиперчувствительности замедленного типа с помощью аллергенов микробного происхождения. Гиперчувствительность замедленного типа развивается у животных при многих инфекциях: туберкулез, бруцеллез. У больного животного появляются в организме клоны Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к определенному аллергену. При введении внутрикожно этому животному соответствующего аллергена сенсибилизированные Т-лимфоциты начинают мигрировать в это место, взаимодействовать с антигеном-аллергеном. При этом Т-лимфоциты выделяют медиаторы воспаления. На месте введения в положительном случае будет реакция воспаления.

6. Экспресс-диагностика.

Данный метод применяется при многих инфекционных заболеваниях. Современными серологическими реакциями (ИФА, РИФ, РИА) можно определить антигенную структуру возбудителя болезни прямо в исследуемом материале, не выделяя чистую культуру возбудителя.

Ход работы:

I.Провести бактериоскопическое исследование на туберкулез, сибирскую язву, бруцеллез.

1.Фиксированный мазок с подозрением на наличие туберкулезной палочки окрасить по Циль Нильсену:

положить на мазок фильтровальную бумажку,

на бумажку налить карболовый фуксин Циля,

мазок подогреть на пламени спиртовки до появления паров,

47

добавить краситель и опять нагреть (нагревают около 5 минут),

бумажку снять,

мазок промыть водой,

обесцветить мазок, опуская его на 30 минут в стаканчик с 5%-ным раствором серной кислоты,

промыть водой,

окрасить раствором метиленовой синьки в течение 5 минут,

промыть водой,

высушить,

микроскопировать.

Устойчивость некоторых бактерий (туберкулезной палочки) к кислотам связана с наличием в их клеточной стенке липидов и восков. Поэтому кислотоустойчивые туберкулезные палочки окрашиваются по методу Циль Нильсена в красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Все другие бактерии обесцвечиваются кислотой и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет.

2.Зарисовать.

3.Окрасить по Граму фиксированный препарат Bacillus anthracis (сибирская язва). Промикроскопировать. Зарисовать.

4.Окрасить по Граму фиксированный препарат Brucella suis (возбудитель бруцеллеза). Промикроскопировать. Зарисовать.

II. Бактериологический метод лабораторной диагностики.

1.Изучить культуральные свойства (колоний) СТИ-вакцинального штамма сибирской язвы и EV-вакцинального штамма чумы. С объективом 8 изучить края колоний. Зарисовать.

2.Сравнить биохимические свойства E.coli и Salmonella по таблице:

Возбудитель	E.coli	Salmonella
Лактоза	КГ	(-)
Глюкоза	КГ	КГ
Индол	(+)	(-)
Сероводород	(-)	(+)

3.Изучить антигенный состав выделенной чистой культуры бактерий в реакции агглютинации на стекле с коли- и сальмонеллезными сыворотками.

48

4.Поставить реакцию кольцепреципетации по Асколи для выявления в испытуемом экстракте из шкурки зайца сибиреязвенного антигена. Сделать выводы.

III.Серологический метод исследования

1.Поставить РА методом кровяно-капельной реакции для диагностики пуллороза цыплят. На часовое стекло внести каплю исследованной гемолизированной крови (Ат?) цыпленка и в нее внести каплю пуллорозного диагностикума (Аг+). При положительном результате че-

рез 4 5 минут появятся агглютинированные хлопья.

2.Учесть пробирочную РА для серодиагностики бруцеллеза, установить наличие Ат. Сделать выводы.

IV.Экспресс-диагностика

1.Учесть реакцию ИФА для выявления в околоплодной жидкости коровы бруцеллезного антигена. Для этого в лунки планшеты внести разные разведения материала (околоплодные воды): 1/2, 1/4, 1/8 и

т.д. Планшеты выдержать в термостате при температуре 37 оС 18 20 часов для адсорбции Аг. Во все лунки с Аг? добавить бруцеллезные Ат, конъюгированные с ферментом пероксидаза хрена, и

выдержать 1 час при температуре 37 оС. Затем тщательно промыть буферным раствором для того, чтобы вымыть не связавшиеся с Аг антитела.

Теперь нужно определить наличие в лунке фермента (если Ат связались с Аг) или отсутствие фермента (если Ат не связались с Аг, т.е. Аг бруцеллезного в лунке не было). Для этого в лунки вносят субстрат для фермента пероксидазы ортофенилендиамин. Реакцию выдерживают в темноте 30 минут и учитывают по изменению цвета субстрата (из бесцветного субстрата он стал желтым при расщеплении ферментом). Сделать выводы.

2.Учесть ИФА при диагностике ящура (выявление серовара А, О или

С?) при помощи Ат, конъюгированного с ферментом.

3.Изучить действие фага методом стекающей капли. V. Результаты исследований занести в протокол.

49

Задача № 1.

В лабораторию поступили мазки-отпечатки из мозга овцы, погибшей, как полагают, от бешенства. Как подтвердить диагноз, если в лаборатории есть люминесцирующая сыворотка к вирусу бешенства?

Ответ: на мазке-отпечатке можно провести прямой вариант реакции иммунофлюоресценции.

Задача № 2.

В лабораторию поступила суспензия ткани легкого свиньи с подозрением на классическую чуму. Как подтвердить диагноз, если в лаборатории имеется: 1) чувствительная культура клеток, 2) среда Игла для клеток, 3) люминесцирующая сыворотка к вирусу классической чумы свиней ?

Ответ: надо вырастить клетки в питательной среде с добавлением антибиотика, внести туда исследуемый материал (суспензию из легкого). Если там есть вирус, он инфицирует клетки. Пораженные вирусом клетки выявить реакцией иммунофлюоресценции (прямой вариант).

Задача № 3.

В лабораторию поступила сыворотка больного животного с подозрением на сальмонеллез. Какими реакциями можно найти титр антител и что нужно иметь для этого в лаборатории ?

Ответ: 1) реакцией агглютинации (Аг сальмонеллезный в виде клеток),

2)реакцией преципитации (лизированные клетки сальмонелл, т.е. молекулярный Аг),

3)реакциями с метками (антииммуноглобулиновые Ат, меченые ферментами, флюорохромом, сальмонеллезными Аг).

Вопрос: Что значит идентифицировать чистую культуру?

Ответ: надо изучить свойства выделенной чистой культуры: 1) морфологические (кокки, палочки и т.д., есть ли капсулы); 2) тинкториальные (как красятся по Граму); 3) культуральные (как растут на питательных средах); 4) биохимические; 5) набор ферментов; 6) антигенные (антигенный состав клетки). По этим свойствам можно определить вид выделенной чистой культуры.

50

Занятие № 10

Тема: Лабораторная диагностика вирусных инфекций.

Цель занятия: Ознакомить с методами лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Материалы и оборудование: Смыв для РГА, 2%-ная взвесь эритроцитов для РГА, часовые стекла, пробирки с МПБ по 4,5 мл, культура E.coli в МПБ, фильтры Зейтца, смесь фага и E.coli в МПБ, стерильные пробирки.

Демонстрация:

1.Мазки по Муромцеву с тельцами Бабеша Негри.

2.Препараты с ЦПД вирусов.

3.ИФА для диагностики ящура.

Вопросы для обсуждения:

1.Структура вирусов.

2.Культивирование вирусов.

3.Примеры вирусных инфекций животных.

4.Особенности вирусных инфекций.

5.Бактериофаги.

6.Титрование бактериофагов.

I. Лабораторная диагностика вирусных инфекций

Диагностика вирусных инфекций складывается из трех методологических направлений:

I. Экспресс-диагностика - обнаружение возбудителя или его компонентов непосредственно в клиническом материале, взятом от больного животного.

Методы экспресс-диагностики могут быть основаны:

1)На прямом микроскопировании мазков-отпечатков пораженной ткани с целью выявления внутриклеточных включений, например при бешенстве;

2)Аг возбудителя может быть выявлен в пораженной ткани с помощью: а) флюоресцентных Ат, т.е. реакцией иммунофлюоресценцииРИФ (бешенство), б) иммуноферментным анализом (ящур, бешенство, грипп птиц), в) иммуноэлектронной микроскопией выявляют образование иммунных комплексов в исследуемом материале при добавлении иммунной сыворотки под электронным микроскопом.

3)Можно изучить структуру ДНКили РНК-вируса методами молекулярной гибридизации или цепной полимеразной реакцией.

	51
II. Вирусологический	метод включает в себя выделение вируса

из клинического материала и его идентификацию. Вирус выделяют на чувствительных клетках и организмах. Затем выявляют присутствие вируса по поражению клеток (цитопатическое действие ЦПД), на пораженной клетке адсорбируются добавленные эритроциты (гемадсорбция), в пораженной вирусом клетке появляются вирусные включения и т.д.

Многие вирусы, находящиеся в жидкости, можно выявить реакцией гемагглютинации. У некоторых вирусов есть на поверхности образования гемагглютинина, которыми склеиваются эритроциты.

Для того чтобы определить вид вируса, надо изучить Аг выделенного вируса с помощью РИФ, ИФА и других методов диагностики.

III. Серодиагностика представляет собой выявление прироста титра антител в сыворотке больного животного. Наиболее употребляемыми методами серодиагностики являются РНГА, ИФА, РИА, РП.

Ход работы:

I. Изучить препараты зараженных вирусами фибробластов. Учесть цитопатическое действие (ЦПД) вируса.

II.Промикроскопировать и зарисовать тельца Бабеша Негри (по Муромцеву) в препарате из мозга собаки, погибшей от бешенства. В окрашенном препарате фон и цитоплазма клеток бледно-голубые, ядра клеток

синие, а тельца Бабеша Негри резко очерченные, фиолетовые с розовым оттенком.

III. Поставить реакцию гемагглютинации для обнаружения вируса гриппа птиц:

Взять каплю отфильтрованного (без бактерий) смыва с глотки курицы и нанести на часовое стекло;

Добавить каплю 2%-ной взвеси эритроцитов, смешать;

Отметить результаты реакции. При положительной реакции образуется хлопьевидный осадок из склеившихся вирусами эритроцитов.

IV. Выделить и протитровать коли-фаг:

В колбу с МПБ произвести посев культуры E.coli. Посев поставить в термостат при 37оС на 3 4 часа;

В колбу с ростом 3 4 часовой культуры E.coli посеять коли-

бактериофаг и выдержать в термостате при 37оС 18 20 часов;

Содержимое колбы отфильтровать через бактериальный фильтр Зейтца. Коли-бактериофаг, находящийся в колбе Бунзена, набрать

52

стерильной пипеткой в стерильную пробирку и использовать его для титрования (10 20 мл).

Титрование по Аппельману

Ингредиенты				Номера пробирок						Контроли
		1	2		3	4	5	6	7	8		9
1.МПБ, мл		4.5	4.5		4.5	4.5	4.5	4.5	4.5	4.5		4.5
2.Культура	фага	0.5										0.5
(фильтрат), мл

Произвести разведение: из 1-й пробирки 0.5 мл перенести во 2-ю, из 2-й в 3-ю и т.д. до 6-й,

из нее 0.5 мл в банку с дез.раствором.

3.Бульонная суточ-	2	2	2	2	2	2		2	-	-
ная культура E.coli в
каплях
Контроли:	7-я пробирка контроль культуры E.coli
	8-я пробирка – контроль стерильности МПБ
	9-я пробирка – контроль фага

V.По готовому ряду Аппельмана учесть опыт и определить титр колифага, в котором нет роста E.coli.

VI. Результаты опытов занести в протокол.

Тесты для проверки знаний:

1.Структура вирусов:

а) клеточная стенка, б) нуклеоид, в) капсид, г) ДНК или РНК.

Ответ: в, г

2. Методы индикации вирусов:

а) окраска препарата по Граму, б) ЦПД, в) РГА, г) окраска препарата по Пешкову, д) выявление внутриклеточных включений.

Ответ: б, в, д

Ключевые слова: вирус, бактериофаг, серодиагностика, цитопатическое действие, гемагглютинация