microbio_zool

53

РАЗДЕЛ V. МИКРОФЛОРА КОРМОВ, МОЛОКА И МОЛОЧНОКИСЛЫХ ПРОДУКТОВ

Занятие № 11

Тема: Микробиологическое исследование кормов.

Цель занятия: Обучить методам исследования грубых и сочных кормов. Материалы и оборудование: предметные стекла, покровные стекла, препа-

ровальные иглы, посев силоса (10-6, 10-7 разведения) в МПБ, суспензия

силоса, индикаторные бумажки для определения рН, посев силоса (10-6 разведение) на МПА, увлажненные солома и зерно, посев зерна и соломы методом аппликации на МПА.

Демонстрация:

1.Рост Cl.perfingens на среде Вильсон Блера;

2.Рост грибков на плотных средах;

3.Рост гнилостных бактерий в МПБ;

4.ИФА для выявления токсина ботулизма. Вопросы для обсуждения:

1.Что такое эпифитная микрофлора и какое ее значение?

2.Почему высушенное сено можно долго хранить?

3.Механизм губительного действия высушивания на микробы.

4.Что лежит в основе силосования корма? Методы силосования сочных кормов.

5.Микроорганизмы, способствующие хорошему качеству силосования.

6.Фазы созревания силосной массы.

7.Методы определения качества силоса.

I. Введение

Грубые корма разнообразны в ботаническом отношении и неоднородны в физическом состоянии. Каждый из них имеет свою технологию и способ хранения, при нарушении которых нередко происходит их порча. Так, например, при увлажнении корма создаются благоприятные условия для размножения гнилостной микрофлоры, плесневых грибов, актиномицетов, которые, развиваясь на растении, используют углеводы, белки, витамины и т.д. и тем самым снижают питательную ценность корма. Кроме того, ряд микроорганизмов могут в процессе своей жизнедеятельности выделять целый ряд токсических продуктов, вызывающих отравление животных. Всесторонний качественный и количественный анализ кормов

54

довольно затруднен, так как не существует универсальной среды, на которой можно вырастить все встречающиеся виды микроорганизмов.

Чаще всего при анализе грубых кормов определяют:

1)санитарную пригодность корма и его общую обсемененность;

2)наличие споровой микрофлоры, способной вызвать заболевания животных (сибирской язвой, эмфизематозным карбункулом, ботулизмом и др.);

3)микрофлору, вызывающую порчу кормов в процессе их хранения;

4)эпифитную микрофлору, играющую большую роль в процессе силосования (гнилостную, молочнокислую, маслянокислую и др.).

II. Микологическое исследование грубых кормов

Среди микрофлоры, вызывающей порчу грубых кормов, видное место занимают грибы. Известно, что корма, пораженные грибками, могут вызывать микозы и микотоксикозы. Первые возникают при попадании в организм и развитии самого грибка, вторые на почве отравления токсинами (ядовитыми продуктами) грибков, развивающихся на кормах. Поэтому исследование пораженных грибами кормов ведут в двух направлениях:

1)обнаружение и выделение грибков возбудителей болезней;

2)определение их токсичности.

Наиболее токсичные свойства обнаружены у многих видов Aspergillus и Fusarium, встречающихся на соломе и мякине злаков, в почве и различных продуктах.

При микологическом исследовании грубых кормов используют препарат “раздавленная капля” или выделяют чистую культуру грибков. Для этого в чашки Петри помещают два кружка фильтровальной бумаги (между которыми кладут тонкий слой ваты), завертывают их и стерилизуют в сушильном шкафу. Перед посевом кружки фильтровальной бумаги увлажняют питательной средой (Чапека или Ван Интерсена) и раскладывают на них исследуемый корм. Ровные отрезки соломки (1.5 2 см) располагают по радиусу на расстоянии 1 2 см друг от друга. Культивирование произ-

водят в термостате при температуре 24 26 оС в течение 10 12 дней. При появлении вокруг соломинок черных, сажистых колоний производят микроскопирование и отсев на косой агар (суслоагар, плотную среду Чапека) для получения чистой культуры. При определении видового состава обращают внимание на строение органов спороношения.

55

III. Определение токсичности грибков

Для испытания токсичности выделенных культур грибков их размножают на доброкачественной соломе, увлажненной жидкой средой (Чапека

или Ван Интерсена) и простерилизованной в автоклаве при 120оС в тече-

ние 30 40 минут. Культивирование грибка производят при 20 25оС в течение 2 3 недель. Затем культуру убивают текучим паром (в течение ча-

са), соломинки высушивают при 40 45оС и извлекают токсин. Экстрагирование токсина производят этиловым эфиром (в течение 6 часов). Вытяжку сгущают и наносят на свежевыбритый участок кожи кролику (ставят дермонекротическую пробу). В качестве контроля на другой участок выбритой кожи наносят вытяжку, полученную из доброкачественной саломы.

Если выделенный гриб образует токсин, то вытяжка из него на 3 4-е сутки вызовет воспалительную реакцию: отечность, покраснение и омертвление ткани. На месте нанесения контрольной вытяжки изменений на коже не произойдет. Токсин (Аг?) можно определить реакцией преципитации с сыворотками.

Элементарным условием сохранения кормов от заплеснения является обеспечение их сухого состояния. Эта задача решается своевременной уборкой кормов, правильным скирдованием и повседневной борьбой с повышением влажности во время хранения.

IV. Исследование кормов на ботулизм

У лошадей и других животных иногда возникают массовые заболевания, связанные с отравлением их токсином ботулизма. Материалом для исследования в этих случаях могут быть остатки несъеденного корма или содержимое желудка падших животных. Внешне этот корм ничем не отличается от доброкачественного, и выделить культуру возбудителя из него не всегда удается. Поэтому прибегают к постановке биологической пробы на морских свинках или выявляют токсин серологическими реакциями.

1.Присланные пробы корма растирают в ступке с постепенным добавлением физраствора (1:2) и оставляют при комнатной температуре на 1 2 часа.

2.Полученную взвесь фильтруют через бумажный фильтр и центрифугируют.

56

3.1 2 мл полученной жидкости с помощью шприца спаивают двум морским свинкам. При наличии токсина ботулинуса морские свинки поги-

бают в течение 3 5 суток при явлениях параличей мышц брюшной стенки и задних конечностей.

4.С фильтратом ставят реакции преципитации и ИФА.

5.Из осадка делают посев в две колбы с бульоном Китт Тароцци под маслом (предварительно прокипяченным) и быстро охлаждают.

6.После посева одну из колб прогревают при 80оС в течение 20 минут (для уничтожения неспоровых бактерий) и культивируют в термостате при 37оС в течение 4 7 дней. При появлении в колбе роста из содержимого делают мазки, окрашивают их по Граму и просматривают с иммерсией. Палочка ботулинуса плектридиальной формы, грамположительная, чистую культуру ее получают в анаэробных условиях на кровяном агаре. Токсичность культуры проверяют на белых мышах, морских свинках или реакциями преципитации и ИФА.

V. Микробиологическое исследование силоса

Силос является одной из главных составных частей кормового рациона сельскохозяйственных животных, поэтому его качественному приготовлению уделяется большое внимание. В основе созревания силоса лежат микробиологические процессы. Одни из этих процессов (как, например, молочнокислое брожение) являются причиной созревания и консервирования силоса, тогда как другие (маслянокислое брожение, гниение) вызывают порчу корма. Оценка качества силоса производится по органолептическим, химическим и микробиологическим показателям. Для контроля за ходом силосования пробы рекомендуется брать в три срока:

1)в момент закладки силосуемой массы (на количественный и качественный состав эпифитной микрофлоры);

2)после созревания силоса (на 10 30-й день после закладки);

3)в момент вскрытия силосного сооружения.

Всвязи с тем, что в разных слоях силосной массы создаются неодинаковые условия для развития микрофлоры, из крупных силосных сооружений (башни, ямы или траншеи) берут не менее трех проб по вертикали: из верхней, центральной и нижней частей.

Из подозрительных участков стога или из кормушек забирают остатки

корма (100 200 г), упаковывают их в два-три слоя чистой бумаги, этикетируют и направляют в лабораторию. Исследование грубых кормов начи-

57

нают с определения его ботанического состава, затем описывают органолептические свойства (цвет корма, наличие налетов, расположение налетов и их окраску и т.д.) и только потом проводят полный бактериологический анализ.

Растительные корма богаты разнообразной бактериальной и грибковой микрофлорой (количество бактерий в 1 г различных растений доходит до 100000 клеток). Однако высокая обсемененность корма сама по себе без учета качественного состава микрофлоры не решает вопроса о его непригодности для вскармливания. Так, например, большая обсемененность травы и свежего сена псевдомонадами или молочнокислыми кокками и палочками является хорошим показателем, Тогда как высокая обсемененность корма бактериями группы E.coli или анаэробными бациллами Cl.perfingens ввиду их потенциальной патогенности является неблагоприятным санитарным показателем.

Органолептическая оценка силоса При органолептическом исследовании обращают внимание на физиче-

ские свойства силоса: структуру, цвет, запах и вкус силосующейся массы. Хороший силос отличается сохранением структур стеблей и листьев.

Цвет их под влиянием органических кислот несколько изменяется до жел- то-оливкового. На воздухе силос быстро темнеет, поэтому определение цвета его следует производить сразу после взятия пробы из силосной массы. Если корм приобрел очень темный цвет, почти черный и стал бесструктурным, это указывает на процессы гниения; такой корм – недоброкачественный.

Запах доброкачественного силоса приятный, напоминающий запах свежего ржаного хлеба, квашеной капусты, соленых огурцов или моченых яблок, иногда слегка спиртовой. Последний обуславливается развитием молочно-кислых бактерий и дрожжей. Резко кислый запах указывает на большое содержание уксусной кислоты, что свидетельствует о более низком качестве силоса. Затхлый и гнилостный запах указывает на обильное развитие в силосе плесеней и гнилостных бактерий, вызывающих порчу корма. Неприятный запах придает силосу масляная кислота, образующаяся в результате неправильно проведенного силосования и указывающая на недоброкачественность силоса.

Определение кислотности силоса Наиболее ярким показателем микробиологических процессов, проте-

кающих в силосе, является его рН. Определение производится ионометром или колометрическим методом по Михаэльсу.

58

Для этой цели из силоса готовят вытяжку или путем настаивания в течение суток одной части силоса с 4 5 частями дистиллированной воды (для прекращения брожения обычно добавляют толуол), или эту навеску силоса (20 г) предварительно растирают в фарфоровой ступке, переносят в колбочку, а затем заливают дистиллированной водой (80 мл). Силос с водой энергично взбалтывают (в первом случае 4 5 раз, во втором – в течение 5 минут), фильтруют через бумажный фильтр и прозрачный фильтрат сразу используют для определения рН.

В доброкачественном силосе рН должно быть не выше 4.0 4.2. Микробиологическое исследование силоса Для общего ознакомления с микрофлорой силоса производят его мик-

роскопическое исследование. Для этой цели небольшое количество силоса (1 2 г) тщательно растирают в стерильной ступке с 1 2 мл стерильной воды и из полученной массы делают обычным способом мазок. Мазок сушат, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают водным раствором какого-нибудь анилинового красителя. Лучше всего окрашивать мазки из силоса карболовым эритрозином (5%-ный раствор карболовой кислоты 100 мл, сухого эритрозина 2 г); окраска производится в течение 20 30 минут. Обычно в мазках, приготовленных из доброкачественного силоса, обнаруживается большое количество палочек, стрептококки, дрожжи. Наличие в препарате плесневых грибков указывает на порчу силоса.

Для характеристики качества силоса производят определение общего числа микроорганизмов и их групповой учет. При этом прежде всего готовят разведение силоса (5 г) и переносят его в колбу со 100 мл стерильной воды. Силос с водой энергично взбалтывают в течение 10 минут и из полученного исходного разведения 1:10 готовят последующие разведения. Для приготовления разведения берут 6 7 пробирок, в которые предварительно наливают по 9 мл стерильной воды. Затем в первую из них пипеткой вносят 1 мл разведения силоса 1:10 (из колбы), тщательно взбалтывают в течение 3 5 минут и 1 мл полученного разведения 1:100 переносят в следующую пробирку и т.д. Таким образом готовят последующие разведения до 10-6 10-7.

Определение в силосе общего количества бактерий Для этого посев суспензии производят на МПА, в двухкратной повтор-

ности. Если силос находится в стадии брожения, для посева берут разведе-

ния10-6 10-7, при исследовании старого силоса 10-6 10-5 и даже меньше.

59

Посев производят следующим образом: стерильной градуированной пипеткой асептично берут 1 мл соответствующего разведения (для каждого разведения нужна отдельная пипетка) и вносят в пустую чашку Петри. Затем в чашку наливают предварительно расплавленный и охлажденный

до 50оС мясо-пептонный агар. Учет молочнокислых бактерий

Производят путем посева 3 4 разведений силосной массы на суслоагаре с мелом (сусло-агар готовят из пива, разведенного водой 1:1 с добавлением 1.5 2%-ного агар-агара). Посевы выдерживают 3 4 дня в термо-

стате при температуре 30 35оС. Вследствие образования кислоты и растворения мела колонии молочнокислых микробов образуют на твердых средах с мелом зоны просветления.

Определение количества маслянокислых бактерий Производят путем посева 3 4 разведений силоса на картофельную сре-

ду Рушмана или на среду Е. Н. Мишустина следующего состава: крахмал 0.5 г; пептон 5.0 г; K2HPO4 1.0 г; мел 5.0 г; водопроводная вода

1000 мл.

Среда разливается по пробиркам с поплавками и стерилизуется в автоклаве при 1 атмосфере 20 минут. Различные разведения силосной массы (от 1:100 до 1:10 000) засевают в пробирки с питательной средой в количестве 1 мл (каждое разведение засевают параллельно в 2 3 пробирки).

Часть из них после посева прогревают при температуре 80оС в течение 10 15 минут, а затем засеянные пробирки выдерживают в термостате при

температуре 35 40оС до 10 суток. В процессе роста маслянокислых бактерий отмечают газообразование, гидролиз, растворение мела и запах прогорклого масла.

Определение гнилостных бактерий Выполняют с помощью посевов 3 4 разведений силоса на МПБ, при

этом между пробиркой и пробкой вставляют полоску фильтровальной бумаги, смоченную 10%-ным раствором уксуснокислого свинца, и красную лакмусовую бумажку.

Гнилостные бактерии вызывают помутнение среды и образование H2S, которую определяют по почернению индикаторной бумажки, смоченной уксуснокислым свинцом, или посинению лакмусовой бумажки при выделении аммиака.

60

Определение количества дрожжей и плесени Производят путем посева силоса на сусло-агар без добавления мела.

Посев производят, как описано выше, из разведений силоса 1:1000

1:10000. Засеянные чашки Петри выращивают при температуре 20 25оС и подсчет выросших колоний производят через 4 суток. Для пересчета всех данных рекомендуется пользоваться таблицами Мак Креди.

Оценка результатов микробиологического исследования силоса Твердых микробиологических норм, характеризующих качество сило-

са, не имеется, и результаты микробиологического исследования дают лишь общее представление о ходе процессов в силосе. Показателями нормально протекающего процесса созревания силоса являются: низкое рН (4), преобладание молочнокислых бактерий (110 млн.), небольшое количество плесеней (до 4 тыс.), бактерий группы кишечной палочки (2500 млн.) и маслянокислых бацилл (250 млн.).

Зрелый силос, в котором правильно протекали микробные процессы, беден микроорганизмами, в то же время силос богат органическими и минеральными веществами, которые находятся в легкоусвояемой форме. Все это делает силос ценным пищевым продуктом для сельскохозяйственных животных.

Ход работы:

I.Определить титр Cl.perfingens на среде Вильсон Блера:

Взвесить 0.1 г измельченного корма, поместить в колбу с 10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно взболтать в течение 5 минут;

Затем 1мл полученной суспензии внести в стерильную чашку Петри и залить питательной средой Вильсон Блера (100 мл 3%-ного МПА и 1%-ной глюкозы); растапливают в водяной бане и добавляют 10 мл 20%-ного раствора сульфита натрия и 1 мл 8%-ного хлористого натрия. Оба раствора готовят на стерильной дистиллированной воде и кипятят;

Через сутки инкубирования в анаэростате при 37 градусах чашки Петри просматривают и отмечают результаты:

отсутствие колоний чистый корм;

1 3 колонии слабозагрязненный корм;

3 10 колоний умеренно загрязненный корм;

более 10 колоний сильнозагрязненный корм;

61

II.Приготовить препарат "раздавленная капля" из мицелия грибков на агаре и из увлажненного грубого корма (зерна, соломы):

Пораженное растение тщательно осмотреть и установить наличие или отсутствие спороношения;

Выявленные на поверхности пораженной ткани спороношения в виде налета подушечек или плодовых тел снять препаровальной иглой и перенести на предметное стекло в каплю 50%-ного раствора глицерина или молочной кислоты;

Налет расправить иглами, накрыть покровным стеклом и изучить с сухими системами микроскопа (8 15 и 40 7);

Промикроскопировать, изучить морфологию грибков, зарисовать.

III.Приготовить препарат из колоний, выросших вокруг зерен, соломы, разложенных на МПА. Окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать.

IV.Ознакомиться с общей микрофлорой силоса. Из суспензии силоса приготовить препарат, окрасить метиленовой синькой. Промикроскопировать,зарисовать.

VI. Определить с помощью индикаторной бумажки рН силоса; VII.Определить общее число бактерий в 1 г силоса. Для этого подсчитать

число колоний на МПА и умножить на степень разведения.

VIII. Определить по росту на МПБ наличие в силосе гнилостных бактерий. IX. Учесть реакцию ИФА для выявления токсина ботулизма.

X. Результаты исследований занести в протокол.

Тесты для проверки знаний:

1.К органолептическим свойствам силоса относят: а) структуру, б) влажность, в) рН, г) цвет, д) запах.

Ответ: а, г, д

2.При микробиологическом исследовании силоса определяют:

а) ОМЧ, б) БГКП, в) споровые бактерии, г) маслянокислые, д) молочнокислые, е) Гр(+)

Ответ: а, б, г, д

Ключевые слова: эпифитная микрофлора, микрофлора корма, силос, маслянокислое брожение, гниение, молочнокислое брожение.

62

Занятие № 12

Тема: Микробиологическое исследование молока и молочнокислых продуктов.

Цель занятия: Обучить методам исследования молока и молочнокислых продуктов.

Материалы и оборудование: Стерильная посуда (пипетки, микропипетки, чашки Петри, пробирки, скальпель), набор красителей, предметные стекла, 1%-ный водный раствор метиленовой синьки, жидкость Никифорова, МПА (высокие столбики), стерильная водопроводная вода по 9 мл в пробирках и по 20 мл, молоко, кисломолочные продукты (сметана, кефир или кефирные зерна).

Демонстрация:

1.Опыт в пробирках для определения редуктазы в молоке.

2.Опыт в чашках Петри для определения лизоцима в молоке.

3.Чашки с ростом для определения микробного числа молока.

4.Стерильные среды Эндо, Козера, Кесслера с глюкозой.

5.Среды с ростом БГКП Кесслера, Эндо, Козера и среда с глюкозой. Вопросы для обсуждения:

1.Источники микрофлоры молока.

2.Смена фаз при хранении молока.

3.Молоко как возможный источник патогенных микробов.

4.Порок молока, микробы – участники.

5.Какие вам известны способы консервирования молока?

6.Методы микробиологического исследования молока.

7.Как взять пробу молока для бактериологического исследования?

8.Какими требованиями должно отвечать молоко группы А?

9.Какие вы знаете кисломолочные продукты?

10. Какие микроорганизмы участвуют в молочнокислом брожении?

12.Микробиология маслоделия, сыроделия.

13.Какие вы знаете пороки микробного происхождения, связанные с хранением масла и сыра?

I. Введение

Молоко является продуктом питания и средой для развития микроорганизмов. Качество молока определяется рядом показателей физических,