microbio_zool

			23
2. Установить		соответствие	действия	антибиотика	на
микроорганизмы:
1)	Пеницилин	а)блокирует синтез белка;
2)	Стрептомицин	б)нарушает синтез клеточной стенки;
		в)нарушает синтез ДНК;

г)блокирует синтез пептидогликана Ответ: 1) б, г; 2) а, в

Ключевые слова: антибиотики, ферменты, аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы.

Занятие № 5

Тема: IV этап выделения чистой культуры. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Понятие о стерилизации и дезинфекции.

Цель занятия: Определить род и сделать посевы для определения вида выделенной чистой культуры. Изучить и дать оценку результатов воздействия на микроорганизмы физических, химических и биологических факторов внешней среды (анализ посевов предыдущего занятия); влияние антибиотиков на рост микробной культуры.

Материалы и оборудование: Студенческие посевы, микроскопы, бактериологические петли, "Краткий определитель бактерий Берги" (1980), чашки Петри с МПБ, среды (Гисса, Пешкова), центрифужные пробирки с плазмой крови для определения коагулазы.

Вопросы для обсуждения:

1.Подвижность бактерий, методы определения.

2.Методы оценки антимикробного действия факторов внешней среды.

3.Понятие о стерилизации.

4.Методы стерилизации.

5.Понятие о дезинфекции. Дезинфецирующие химические вещества и механизм действия на микробную клетку.

I. Антимикробное действие факторов внешней среды

1.Температура. Наибольшая температура, при которой возможно развитие микроорганизмов, называется максимальной. Большинство микроорганизмов плохо переносит превышение максимальной температуры раз-

вития. Уже при 55 60 оС возможна тепловая коагуляция белка, при которой клетка погибает. Для уничтожения вегетативных форм большинства

24

микроорганизмов используют температуру в пределах 61.5 85.0 оС и экспозицию от 3 до 30 минут. Гибель микроорганизмов под воздействием высоких температур наступает вследствие денатурации клеточных белков, разрушения осмотического барьера клетки, нарушения равновесия ферментативных реакций и т.д.

2.Кислотность среды. Большинство микроорганизмов развивается в нейтральной (рН = 7.0), слабощелочной (рН = 7.2 7.3) или слабокислой (рН = 6.8 6.9) среде. Для мицельных грибов и дрожжей благоприятной является слабокислая среда, для бактерий нейтральная. На развитие микроорганизмов влияют значительные отклонения концентраций водородных и гидроксильных ионов от видовых потребностей к реакции среды.

3. Осмотическое давление. При высокой концентрации растворенных в воде веществ у большинства микроорганизмов наступает плазмолиз клетки протоплазма выделяет воду и уплотняется; затормаживаются процессы обмена веществ и клетка переходит в состояние анабиоза. Некоторые виды микроорганизмов (осмофилы) способны легко переносить высокие концентрации растворов и даже нуждаются в них.

4. Антисептики. Это химические вещества, избирательно действующие на микроорганизмы. Относятся к группе общепротоплазматических ядов, действующих не только на микроорганизмы, но и на любую живую или растительную клетку. В качестве антисептиков широко применяют 0.5 5.0%-ные растворы фенола, 0.1 10%-ные растворы хлорной извести.

5. УФО. Рассеянный свет не оказывает заметного отрицательного влияния на большинство бактерий. Прямой солнечный свет действует на них губительно. Сильным бактерицидным действием обладают ультрафиолетовые лучи. УФО вызывает повреждения матричной РНК, обусловленные разрывом связей в тиминовых димерах. Повреждения, вызванные УФО, частично обратимы.

II. Стерилизация

Стерилизация (лат.sterilis бесплодный) полное уничтожение микроорганизмов в питательной среде, посуде и т.д. В основу стерилизации положена способность бактерицидных агентов вызывать гибель микроорганизмов и их спор. К таким агентам относятся высокая температура, лучевая энергия, некоторые химические соединения.

I. Стерилизация под действием высоких температур. Эффектив-

ность бактерицидного действия температурного фактора зависит от степе -

25

ни нагревания, продолжительности воздействия данной температуры, вида микроорганизма и состава среды, в которой он культивируется.

Стерилизация под воздействием высоких температур осуществляется разными способами:

1.Прокаливание (фламбирование) до и после употребления прокаливание в пламени спиртовки бактериологической петли, иглы, кончиков пинцетов и других металлических предметов.

2.Стерилизация кипячением производится в стерилизаторе на слабом огне, во избежание разбрызгивания жидкости.

3.Пастеризация означает нагревание при 65 80 оС 30 минут с после-

дующим быстрым охлаждением до 10 11 оС; направлена на уничтожение вегетативных клеток бактерий и спор грибов. Пастеризация используется в пищевой промышленности.

4. Стерилизация фильтрованием используется для стерилизации синтетических сред определенного состава, которые содержат легкоразлагающиеся или летучие компоненты витамины, аминокислоты цистеин и цистин, белки, ароматические углеводы, их производные и пр. Фильтрование жидкостей осуществляется через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолит. Для стерилизации используют также фильтры, изготовленные из каолина с примесью кварцевого песка, "свечи" Шамберлена, и из инфузорной зелени "свечи" Бернфельда.

5. Стерилизация горячим воздухом (сухим жаром) осуществляется в

сушильных шкафах при температуре 160 180оС в течение 2 часов.

6. Стерилизация текучим паром (тиндализация) применяется для сред,

портящихся под действием температур больше 100 оС. Используют дробную стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 минут в течение трех дней ежедневно.

7. Стерилизация насыщенным паром под давлением основывается на нагревании материала насыщенным паром при давлении выше атмосферного. Режим стерилизации (избыточное давление и время) выбирают в зависимости от характера стерилизуемого материала. Стерилизацию проводят в автоклаве, который представляет собой герметически закрывающийся двустенный металлический котел.

26

II. Стерилизация облучением связанна с использованием УФ лучей, источником которых являются специальные бактерицидные лампы. На клетки бактерий летальный эффект оказывают ультрафиолетовые, рентгеновские, гамма-, альфа-, бета-лучи и нейтроны.

III. Химическая стерилизация (дезинфекция) представляет собой уда-

ление или разрушение патогенных микробов, находящихся на неживых поверхностях или объектах, с помощью дезинфицирующих веществ. Бактерицидное действие химических агентов обуславливается активностью функциональных групп, концентрацией активного компонента данного вещества, длительностью контакта, рН, температурой, влажностью, присутствием органического вещества. В качестве дезинфицирующих агентов применяют галогены, фенол и их производные, соединения тяжелых металлов, спирты, микробоцидные газы и т.д.

Ход работы:

I.Произвести учет пестрого ряда:

Учесть изменение цвета сред пестрого ряда, отметить наличие или отсутствия выделения газообразных продуктов;

Определить наличие индола, аммиака и сероводорода по изменению цвета индикаторных бумажек. Заполнить сводную таблицу биохимических свойств бактерий и наличия продуктов метаболизма.

Физиологические свойства

МПБ

Тип дыхания, рост по Глюкоза Каталаза Сероводород Индол Аммиак уколу в МПА

II.Определить род выделенного микроба по соответствующей групповой таблице, используя "Краткий определитель бактерий Берги (стр.266) и руководствуясь следующими признаками:

1.Движение (подвижный, неподвижный);

2.Расщепление глюкозы до газа (+) / (-) или кислоты (+) / (-);

3.Наличие или отсутствие каталазы (+) / (-);

4.Наличие или отсутствие сероводорода (+) / (-);

5.Наличие или отсутствие индола (+) / (-);

4. Наличие или отсутствие аммиака (+) / (-).

27

III.Оценить бактерицидное действие физических и химических факторов внешней среды по наличию и величине задержки роста микробной культуры, обработанной УФО, сулемой, фенолом; измерить диаметр зоны.

IV. Результаты опыта записать по форме:

Исследуемый	Фенол	Сулема	УФО	Заключение
признак
Зона задержки роста

V.Проанализировать влияние антибиотиков на микробную культуру. Отметить отсутствие или наличие зоны задержки роста микробов. Отсутствие зоны задержки роста указывает на устойчивость выделенного вида микроорганизма к данному антибиотику.

Результаты записать по форме:

Название антибиотика	Величина зоны за-	Заключение
	держки роста при дей-
	ствии, мм

VI.Пользуясь "определителем", сделать посевы чистой культуры для последующего определения вида выделенной культуры бактерий.

VII.Результаты исследований и выводы занести в протокол.

Тесты для проверки знаний:

1.Действие УФО связано с: а) бактерицидным действием на микробную культуру, б) нарушением целостности ЦПМ, в) действием на тиминовые димеры, г) действием на гликопептидный слой.

Ответ: а, в

28

2.При тиндализации используются: а) УФО, б) стерилизация текучим паром, в) фильтрация, г) дробная стерилизация, д) кипятильник Коха.

Ответ: а, г, д

Ключевые слова: антисептики, стерилизация, дезинфекция, пастеризация, тиндализация

Занятие № 6

Тема: Генетика микроорганизмов.

Цель занятия: Изучить механизмы передачи наследственной информации с помощью трансформации, трансдукции и конъюгации.

Материалы и оборудование: ДНК, полученная из стрептомициноустойчивой культуры донора; стрептомициночувствительная культура E.coli (реципиент); культура E.coli lac – (реципиент); умеренный трансдуцирующий фаг; культура кишечной палочки (Hfr донор) с генотипом: pro + (пролин), thr + (треонин), leu + (лейцин), Str s стрептомициночувствительный; культура кишечной палочки (F–) реципиент с генотипом: pro – , thr –, leu –, Str r стрептомицинорезистентный; чашки Петри с МПА и стрептомицином в концентрации 100 ЕД/мл, чашки Петри с дифференциально диагностической средой Эндо, минимальная питательная среда с добавлением стрептомицина 100 ЕД/мл; стерильные градуированные пипетки.

Вопросы для обсуждения:

1.Генотип и фенотип бактерий.

2.Фенотипическая изменчивость у микроорганизмов.

3.Генотипическая изменчивость у микроорганизмов.

4.Трансформация у бактерий, ее сущность.

5.Трансдукция и лизогенная конверсия.

6.Механизм конъюгации.

7.Бактериальные плазмиды, их классификация.

I. Генетические рекомбинации прокариот

Генетические рекомбинации у микроорганизмов имеют особенности. У эукариот это происходит при половом процессе с помощью реципрокного обмена фрагментами хромосом, при этом возникают две рекомбинативные особи. У прокариот в одну из клеток (реципиент) проникает не вся, а

29
только часть ДНК (донора), что приводит	к	образованию

мерозиготы и при этом образуется один рекомбинант. Передача генетического материала от одной бактерии другой осуществляется следующими способами:

1.Трансформация. Заключается в переносе генетической информации путем пиноцитоза бактерией-реципиентом из внешней среды фрагментов хромосомы лизированной клетки-донора. Способность к пиноцитозу ДНК свойственна только бактериям, находящимся в состоянии компетенции. В одних случаях поглощенный фрагмент разрушается нуклеазами хозяина (абортивная трансформация). В других он интегрирует с хромосомой, образуя мерозиготу, после чего клетка делится. Ее потомство наследует признаки характерные для донора и реципиента.

2.Трансдукция. При трансдукции передача генетического материала осуществляется с помощью умеренного бактериофага. При общей трансдукции передается любой фрагмент хромосомы бактерии. При специфической трансдукции переносятся определенные гены, которые расположены в хромосоме рядом с трансдуцирующим фагом. Фрагмент ДНК интегрирует с хромосомой бактерии-реципиента, образуя мерозиготу, и при делении передает информацию потомству. При абортивной трансдукции фрагмент ДНК донора не интегрирует с геномом клетки-хозяина и не передается потомству.

3.Конъюгация. Под конъюгацией понимают половой процесс, при котором в результате физического контакта (через sex-пили) происходит передача генетического материла от донора к реципиенту. Процесс контролируется половой плазмидой F+-фактор. При конъюгации образуется мерозигота и потомство может иметь смешанный геном.

Ход работы:

I.Поставить опыт передачи устойчивости к стрептомицину у кишечной палочки (E. coli) путем трансформации.

Культуру клеток E.coli в объеме 1 мл соединить с равным количеством ДНК культуры донора и выдеражать смесь в термостате при 37о в течение 30 минут для контакта.

Произвести посев смеси на МПА, содержащий стрептомицин.

Произвести контрольные посевы: реципиента и ДНК донора.

30

Учесть опыт через 24 48 часов. Контрольные посевы на среде, содержащей стрептомицин, стерильны. В опыте будет наблюдаться рост колоний трансформантов.

Сделать выводы.

II.Поставить опыт по передаче «lac» маркера у E.coli с помощью бактериофага.

К 1 мл 4-часовой культуры реципиента (E.coli lac ) добавить 1 мл трансдуцирующего фага. Смесь выдержать в термостате при 37о в течение 30 минут для контакта.

Произвести посев смеси на среду с лактозой.

Произвести контрольные посевы: культуры реципиента и фага.

Учесть опыт через 24 48 часов.

Сделать выводы.

III.Поставить опыт по передаче маркеров “pro”, “leu”, “thr” в скрещивание типа Hfr x F у кишечной палочки.

В опытную пробирку в соотношении 1:10 внести культуру донора

(0.1 мл) и реципиента (0.9 мл). Скрещиваемую смесь поставить в итермостат при 37о и выдержать 30 минут. В течение этого времени проксимальные маркеры донора входят в бактерию реципиента.

Произвести посев смеси и контроли (культуру донора и реципиента) на минимальную среду со стрептомицином .

Учесть опыт через 24 48 часов.

Сделать выводы.

Задача:

Получить прототрофный рекомбинантный штамм Bac.subtilis, устойчивый к ампициллину, если в лаборатории имеются: 1) Bac.subtilis Hfr amp r ауксотроф; 2) Bac.subtilis F _ amp s прототроф, 3) МПА с ампициллином, 4) Глюкозо-солевая среда с ампициллином.

Ответ: Штамм можно получить с помощью опыта по передаче маркеров прототрофности и устойчивости к ампициллину в скрещивании типа Hfr x F у сенной палочки путем конъюгации.

Ключевые слова: генотип, фенотип, рекомбинации, плазмиды.

31

РАЗДЕЛ III. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Занятие № 7

Тема: Санитарно-бактериологическое изучение природных биоценозов. Цель занятия: Обучить санитарно-бактериологическим методам исследования природных биоценозов.

Материалы и оборудование: Колба Бунсена, фильтр Зейтца, расплавленный МПА, чашки Петри со средой Эндо, стерильные чашки Петри, стерильные градуированные пипетки, чашки Петри с МПА, чашки Петри с кровяным агаром, почвенная болтушка в разведении 1: 10.

Демонстрация:

1.Аппарат Кротова для определения наличия гемолитического стафилококка в воздухе

Вопросы для обсуждения:

1.Свойства микроорганизмов, определяющие их повсеместное распространение в природе.

2.Сапробность и микробное число воды.

3.Оценка степени загрязнения воды бактериями группы кишечной палочки (БГКП). Понятия Coli-титра и Coli-индекса.

4.Микрофлора воздуха. Общая бактериальная обсемененность воздуха.

5.Методы определения санитарно-бактериологического состояния воздуха: аспирационный, седиментационный.

6.Микрофлора почвы: методы определения санитарнобактериологического состояния почвы. Классификация почв по степени загрязнения.

I. Микрофлора воды

Микрофлора воды делится по составу микробиоценозов на микрофлору подземных вод (артезианской, ключевой), микрофлору поверхностных вод (рек, озер, водохранилищ) и микрофлору питьевой воды. Степень загрязнения водоемов органическими веществами и наличие в них микроорганизмов соответствует определенным зонам сапробности:

1.Олигосапробная зона содержит мало органических веществ и мало бактерий от 10 до 1000 в 1 мл воды;

2.Мезосапробная зона – зона более загрязненной воды, где происходит минерализация органических веществ с интенсивным окислением и

32

выраженной нитрификацией. Количество бактериальных клеток мень-

ше 100 000 в 1 мл;

3.Полисапробная зона – зона сильного загрязнения: бедна кислородом, богата органическимим соединениями. Число бактерий в ней доходит до 1000000 и более в 1 мл. Преобладают E.coli и анаэробы, вызывающие процессы гниения и брожения.

Наличие E.coli в воде является признаком свежего фикального загрязнения и наличия в воде патогенных микроорганизмов. При санитарнобактериологическом исследовании воды выделяют бактерии группы кишечной палочки (БГКП), определяют Coli-T, Coli-Ind, общее микробное число воды (ОМЧ воды) и другие показатели (табл. 1).

К БГКП относят Гр (-) микроорганизмы, не образующие спор, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа и не обладающие оксидазной активностью. Coli-Т это наименьшее количество жидкости в миллилитрах, в котором содержится 1 E.coli. Coli-Ind это количество особей E.coli, которое находится в 1 литре.

			Т а б л и ц а 1
	Оценка эпидемиологической опасности воды
	по индикаторным микроорганизмам
№	Показатели оценки	Ед. измерения	Норматив
1	Термотолерантные колиформ-	Число бактерий в 100 мл	отсутствие
	ные бактерии (до 37 o С)	(ранее было 333)
2	Общие колиформные бактерии	Число бактерий в 100 мл	отсутствие
		(ранее было 333)
3	ОМЧ	Число образовавшихся коло-	50
		ний в 1 мл
4	Колифаги (индикатор загрязне-	Число бляшкообр.ед.	Должны отсутст-
	ния воды вирусами)	в 100 мл	вовать в 100 мл
5	Споры	Число спор в 20 мл	отсутствие
6	Цисты лямблий	Число цист в 50 мл	отсутствие

Методы санитарно-бактериологического исследования воды:

1.Метод двухфазной бродильной пробы. Сущность метода заключается

впосеве заданного объема воды в среду Эйкмана (глюкозо-пептонную среду). Общий объем воды открытых водоемов 111.1 мл ( 100, 10, 1, 0.1), а для водопроводной воды 333 мл ( 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл, и 3 объема по 1 мл). Посевы выдерживают в течение 24 часов в термостате