microbio_zool

63
химических и бактериологических. Физические	и	химические

показатели характеризуют питательную ценность молока, а бактериологические позволяют судить о свежести молока и степени его загрязнения. При помощи этих показателей можно контролировать санитарные требования при дойке, обработке, хранении и транспортировке молока. Некоторые бактериологические показатели (наряду с физическими и химическими) характеризуют состояние вымени животного, т. е. наличие или отсутствие в нем воспалительного процесса. Микрофлора молока складывается из ряда источников: 1) микрофлора вымени; 2) внешние источники заражения молока (кожа животного, посуда и аппаратура, вода, корм, подстилка, воздух, тело и одежда доярки) как источники первичной микрофлоры молока. Вторичная микрофлора молока это накопление микрофлоры в молоке путем размножения ранее попавших в него микроорганизмов.

II.Взятие материала для исследования молока

Взависимости от поставленных задач исследования пробы молока берут от одной определенной коровы или от группы коров.

При взятии пробы молока от одной коровы: 1) готовят стерильную посуду; 2) вымя коровы тщательно моют теплой водой с мылом, протирают стерильным полотенцем, соски дезинфицируют ватным тампоном, смоченным спиртом; 3) доильщицы тщательно моют и дезинфицируют руки;

4)из каждого соска поочередно молоко сдаивают в стерильную посуду: а)

первые 3 4 струйки (при исследовании это микрофлора кожи животного), в пищу они не идут и не уничтожаются; б) средние струйки (микрофлора молока); в) последние струйки (микрофлора вымени). При исследовании последних струек молока и наличии в них лейкоцитов и микроорганизмов можно выявить мастит (воспаление молочной железы). Все пробы этикетируются и направляются на исследование в лабораторию.

При взятии молока от группы коров: 1) молоко во флягах тщательно перемешивают мутовкой медленными круговыми движениями; 2) забор проб молока производят стерильным пробником (длинная стеклянная трубка) в количестве 50 мл и сливают в стерильный флакон. Флакон закрывают над пламенем спиртовки ватной пробкой. Нумеруют, на этикетке

64

указывают дату взятия пробы (число и час), а также фамилию, имя, отчество и должность лица, производившего взятие пробы.

Исследование взятых проб молока производят сразу или не позднее 2-х часов с момента взятия проб. Если молоко не может быть немедленно ис-

следовано, то его охлаждают до + 4 6оС, хранят и транспортируют при этой же температуре.

Основными бактериологическими показателями, характеризующими свежесть молока и его чистоту, являются: а) количество бактерий в 1 мл молока (микробное число), б) коли-титр молока (наименьший объем молока, в котором обнаружена одна БГКП).

Микробное число молока можно определить: 1) бактериологическим способом (высев определенного объема молока на специальные среды с последующим подсчетом выросших колоний; 2) методом прямого подсчета бактерий под микроскопом (метод Брида, Королева, Разумовой и т.д.); 3) косвенными методами: а) с помощью пробы на редуктазу; б) с помощью пробы с резазурином.

II. Микробиологическое исследование молочнокислых продуктов

Типичные молочнокислые бактерии неподвижны, Гр (+), слабо или совсем не растут на МП-ых средах. Молочнокислые бактерии молока при сбраживании углеводов образуют в основном молочную кислоту, побочные продукты обычно мало заметны. Но встречаются молочнокислые бактерии, которые при брожении наряду с молочной кислотой образуют значительное количество летучих кислот (уксусной, углекислоты), спирт, диацетил и при развитии совместно с активными молочнокислыми бактериями придают молочным продуктам своеобразный специфический вкус и аромат. Молочнокислые микроорганизмы представлены тремя группами: молочнокислые стрептококки, молочнокислые палочки, дрожжи.

Ход работы:

I.Определить количество бактерий в 1 мл молока (методом посева):

Приготовить серийное разведение молока: а) взять 4 пробирки с 9 мл водопроводной воды и подписать: № 1, 2, 3, 4; б) взятую пробу молока тщательно взболтать и стерильной пипеткой набрать из нее 1 мл молока и внести в пробирку № 1, тщательно перемешать, соблюдая все правила асептики , и перенести в пробирку № 2 и т.д. Вы получите разведения молока: № 1 (1:10), № 2 (1:100), № 3 (1:1000), № 4 (1:10000).

65

Взять 1 стерильную чашку Петри, подписать "молоко 1:10000". В чашку внести 1 мл из пробирки № 4, залить чашку расплавленным и охлажденным до 45 50оС МПА (15 мл). Образовавшуюся смесь тщательно перемешать путем вращения чашки и оставить на столе до полного застывания агара.

Чашку перевернуть вверх дном и поставить в термостат на 48 часов.

По демонстрационным чашкам подсчитать микробное число.

II.Провести микроскопическое исследование кисломолочных продуктов:

Приготовить мазок из сметаны, высушить на воздухе, зафиксировать в жидкости Никифорова и окрасить метиленовой синькой (3 мин). Мазок промыть, подсушить фильтровальной бумагой. Промикроскопировать с иммерсионной системой. Отметить наличие молочнокислых стрептококков, палочек и дрожжей, сбраживающих лактозу.

Приготовить мазок из кефира: а) зерно кефира поместить между двумя стерильными стеклами и раздавить его; б) полученные на стекле отпечатки высушить, зафиксировать и окрасить метиленовой синькой, промикроскопировать, зарисовать и отметить наличие единичных дрожжей, молочнокислых стрептококков, молочнокислых бактерий и палочки стромы.

Тесты для проверки знаний:

1.Молоко 1 класса имеет следующие характеристики: а) сине-стальную окраску, б) количество бактерий > 20 млн/мл, в) количество бактерий < 20 млн/мл, г) белую окраску, д) количество бактерий менее 500 тыс/мл.

Ответ: а, д

2.В лаборатории имеется: 1) сырое цельное молоко, 2) пастеризованный обрат, 3) сыворотка молочная, а также закваски: а) молочный срептококк, б) ацидофильная палочка. Что необходимо использовать, чтобы приготовить ацидофилин для телят ?

Ответ: 1, 3 б

Ключевые слова: ОМЧ молока, Coli-титр молока, молочнокислые бактерии, кисломолочные продукты

66

Занятие № 13

Тема: Препараты, используемые для лечения, профилактики и диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Цель занятия: Изучить вакцины, сыворотки, иммуноглобулины, аллергены и способы их применения.

Материалы и оборудование: Набор препаратов лечебного, профилактического и диагностического назначения в животноводстве.

Вопросы для обсуждения:

1.Вакцины, их назначение, виды вакцин.

2.Иммунные сыворотки, их назначение.

3.Способы получения лечебно-профилактических препаратов.

4.Иммуноглобулины, их назначение.

5.Аллергены, их получение и использование.

6.Диагностические сыворотки, их получение, применение.

7.Диагностикумы, их получение, применение.

8.Применение бактериофагов для лечения и диагностики.

I. Профилактические и лечебные препараты

Одним из важнейших направлений прикладной иммунологии является создание эффективных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний. Среди таких препаратов различают:

1.Вакцины и анатоксины.

2.Иммунные сыворотки и иммуноглобулины.

Вакцины Вакцины препараты, используемые для активной иммунизации лю-

дей и животных. Э.Дженнером была получена первая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы (vacca - корова). Название вакцины было дано Л. Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микроорганизмов и их продуктов. Вакцины должны обладать определенными свойствами (физико-химическими, антигенными) и при правильном дозировании и введении животным давать соответствующую реакцию и создавать активный иммунитет против той или иной болезни.

Различают вакцины живые, убитые, субъединичные, генноинженерные и другие.

67

Живые вакцины изготовляют из специально полученных штаммов микроорганизмов с ослабленной вирулентностью и полноценными иммуногенными свойствами. Для этого вначале прибегают к селекции и направленному изменению бактериальных культур и вирусов (на фоне сохраненной антигенной структуры). Это достигается: выращиванием возбудителя в средах, недостаточно для его развития благоприятных (туберкулезная вакцина в БЦЖ); пассажами через организм маловосприимчивых животных (вакцина против рожи свиней, вакцина против бешенства, вакцина против вируса чумы свиней и вируса Ньюкастловской болезни); обработкой химическими веществами и физическими агентами (вакцины против пастереллеза птиц, против сибирской язвы (СТИ, ГНТИ), вакцины Ценковского, бруцеллеза ВА-19, против паратифа телят Тс-177).

Живые вакцины обычно более эффективны, создают, как правило, напряженный иммунитет, сходный с постинфекционным. В большинстве случаев достаточно бывает однократной вакцинации живой вакцины, так как вакцинный штамм может размножаться и персистировать в организме.

Однако после их применения могут возникнуть поствакцинальные осложнения, особенно у животных с пониженной резистентностью к заболеваниям. Вакцины чаще леофильно высушивают: из замороженного состояния, в вакууме.

Убитые вакцины представляют собой взвесь убитых (инактивированных) микроорганизмов. Их готовят из штаммов микроорганизмов, обладающих максимально выраженными иммуногенными свойствами. Для инактивации вакцин используют разные методы: нагревание, УФ-лучи, ультразвук, химические вещества (спирт, формалин, фенол и другие). Инактивацию проводят в условиях, исключающих денатаруцию антигенов. Примерами убитых вакцин могут служить: формолвакцина против эмфизематозного карбункула, формолвакцина против оспы свиней и против паратифа телят.

Вакцины, содержащие убитые микробы, безопасны, вызывают медленное образование иммунитета и менее эффективны в условиях действующего очага инфекции.

Следует учитывать, что аттенуированный (ослабленный) или убитый возбудитель это множество различных антигенных детерминант, из которых протективностью, т.е. способностью индуцировать защитный иммунитет, обладают очень немногие. В связи с этим целесообразно усовер -

68

шенствовать вакцины путем использования компонентов бактериальной клетки и вирионов, обладающих наиболее выраженным протективным действием.

Вакцины, содержащие отдельные антигенные комплексы микробных клеток и вирионов, называют субъединичными. При введении их в организм субъединичные вакцины благодаря хорошей растворимости и относительно низкой молекулярной массе быстро метаболируются и выводятся из организма, не обеспечивая длительного иммуногенного раздражения. Поэтому к ним обычно добавляют вещества-адъюванты (adjuvans - помогающий): гидроокись аммония, алюмо-калиевые квасцы, фосфаты аммония, кальция и другие. Адъюванты укрупняют антигенные частицы, созюдают в месте введения депо (депонированные вакцины), т.е. удлиняют период иммуногенного раздражения. Кроме того, адъюванты усиливают фагоцитоз, митоз иммунокомпетентных клеток.

Генно-инженерные вакцины получают поэтапно. Сначала составляют генетическую карту генома данного возбудителя. Затем гены, контролирующие протективные антигены, переносят в геном других микроорганизмов, например в дрожжевую клетку или кишечную палочку, клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях. Синтезируемые новыми клетками антигены (белки) очищают от балластных веществ и адсорбируют на адъювантах. Созданы генно-инженерные вакцины против ящура, бешенства.

Ассоциированные вакцины. Большое значение в животноводстве имеет ассоциированная иммунизация, т.е. введение в организм ассоциированных вакцин, содержащих одновременно антигены нескольких возбудителей, например: ассоциированная вакцина против эмфизематозного карбункула, злокачественного отека и пастереллеза крупного рогатого скота, ассоциированная вакцина против ботулизма и пастереллеза норок.

Анатоксины Анатоксины используют для создания искусственного активного анти-

токсического иммунитета (столбняк, ботулизм и другие). Анатоксин представляет собой экзотоксин (фильтрат бульонной культуры токсигенного микроба), обезвреженный длительным (18 30 дней) воздействием

формалина при температуре 37 40оС.

69

Анатоксин контролируют на стерильность, безвредность и иммуногенность. Анатоксины очищают от балластных белков и адсорбируют на адъювантах.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины При многих бактериальных и вирусных инфекциях антитела играют

защитную роль, нейтрализуя токсины и внеклеточные вирусы, способствуют очищению организма от возбудителя. Однако накопление достаточного количества антител наблюдается, как правило, не ранее чем через 2 3 недели после начала заболевания. Поэтому для создания искусственного пассивного иммунитета используют введение животным иммунных сывороток или иммуноглобулинов.

Сыворотки применяют с профилактическими и лечебными целями. Для профилактики их используют, когда имеется непосредственная опасность заражения, например, столбняком, анаэробными инфекциями при ранении. Сыворотку вводят чаще внутримышечно или внутривенно.

Иммунные сыворотки получают путем многократной иммунизации лошадей, от которых можно получить сравнительно много крови. Животных иммунизируют соответствующими антигенами: анатоксинами для получения антитоксических сывороток и вакцинами для получения антибактериальных и антивирусных сывороток. После окончания иммунизации у животного стерильно берут кровь, из которой получают сыворотку. Сыворотку проверяют на активность (титр антител), стерильность, безвредность, очищают от балластных белков. Чаще для этого применяют метод ферментативного гидролиза, осаждение активных фракций сульфатом аммония и диализ «Диаферм».

Из сывороток получают иммуноглобулины путем спиртоводного осаждения при низкой температуре. Из крови гипериммунизированных животных получают иммуноглобулины против бешенства, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и т.д.

II. Диагностические препараты

Диагностические препараты используются для:

1)определения с помощью специальных иммунных сывороток вида и типа микроорганизма, выделенного от больного животного;

2)обнаружения антител в сыворотке больного животного;

3)выявления аллергической перестройки организма, возникающей при некоторых инфекционных заболеваниях.

70

Диагностические сыворотки Диагностические сыворотки содержат специфические антитела, с их

помощью можно выделить антигены соответствующего возбудителя. Диагностические сыворотки подразделяются на агглютинирующие, преципитирующие, нейтрализующие, люминисцентные, меченые (конъюгированные) ферментом и другие.

Все диагностические иммунные сыворотки готовят путем иммунизации животных (кроликов, лошадей) соответствующим антигеном. Полученные от иммунизированных животных сыворотки титруют (определяют титр соответствующих антител), в стерильных условиях разливают в ампулы.

Свободные аминогруппы Fc фрагментов антител в иммунных сыворотках можно конъюгировать ферментами, флюоресцентными красителями, изотопами. Эти сыворотки используют для диагностики в реакциях ммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализа.

Диагностикумы Диагностикумы используют для определения специфических антител в

сыворотке животного. Чаще всего диагностикумы представляют собой гомогенную взвесь убитых микробов или вирусов. Диагностикумы из большинства бактерий готовятся путем инактивации их взвеси формалином, этиловым спиртом, прогреванием и другими методами.

В ряде случаев для серодиагностики применяют не целые микроорганизмы, а выделенные из микробных тел антигены. Это достигается различными методами: дезинтеграцией химическими веществами, кипячением, ультразвуком и т.д.

Бактериофаги Бактериофаги характеризуются высокой специфичностью, поэтому их

можно использовать для:

1)фаготерапии лечения некоторых инфекционных заболеваний;

2)фагопрофилактики предупреждения некоторых заболеваний;

3)диагностики.

Аллергены Аллергены это препараты, которые применяют с целью диагностики

соответствующего заболевания, для выявления иммунологической перестройки организма в результате вакцинации или заболевания. Основные требования к аллергенам высокая чувствительность и специфичность.

71

Микробные аллергены чаще готовят из фильтратов бульонных культур. Вводят накожно, внутрикожно или на конъюктиву глаза.

При положительной реакции на месте введения аллергена развивается местная воспалительная реакция: отечность, гиперемия, выделение гноя из внутреннего угла глаза и др.

Ход работы:

I. Изучить вакцины:

а) живые вакцины БЦЖ, СТИ, б) убитые вакцины, в) субъединичные вакцины.

II. Изучить анатоксины: столбнячный, ботулинический.

III.Изучить иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Просмотреть образцы следующих сывороток:

а) сыворотку против сибирской язвы,

б) сыворотку против паратифа поросят, в) поливалентную сыворотку против лептоспироза.

IV.Изучить аллергены. Просмотреть образцы следующих аллергенов: а) альтуберкулин Коха, б) туберкулин ППД, в) бруцеллизат ВИЭМ, г) бруцеллин ВИЭМ.

Разобрать способы введения.

V.Изучить диагностические сыворотки:

а) агглютинирующую сальмонелезную поливалентную, б) агглютинирующую сальмонелезную групповую О-сыворотку,

в) агглютинирующую сальмонелезную типовую Н-сыворотку, г) люминесцирующую сыворотку чумную, д) люминесцирующую сыворотку бруцеллезную,

е)преципитирующую сибиреязвенную сыворотку. Просмотреть образ-

цы сывороток, разобрать способы их приготовления, применения. VI.Изучить диагностикумы:

а) сальмонелезный ОН-диагностикум, б) бруцеллезный диагностикум,

в) эритроцитарный сибиреязвенный диагностикум, г) бруцеллезный эритроцитарный диагностикум. Просмотреть образцы

диагностикумов, разобрать способы их получения, применения.

72

VII. Изучить бактериофаги:

а) для лечения: стафилококковый, стрептококковый, б) для диагностики: чумной диагностический фаг.

Тесты для проверки знаний:

1.Туберкулины для аллергодиагностики животному вводят:

а) внутрикожно, б) внутривенно, в) внутримышечно, г) на конъюктиву.

Ответ: а, г

2.Для активной иммунизации против сибирской язвы животным вводят: а) противосибиреязвенную сыворотку, б) вакцину СТИ, в) вакцину ГНТИ, г) противосибиреязвенный иммуноглобулин, д) вакцины Ценковского.

Ответ: б, в, д

3. Живые вакцины:

а) содержат иммуноглобулины, б) создают пассивный иммунитет организма, в) создают активный иммунитет, г) состоят из аттенуированного штамма.

Ответ : в, г

Ключевые слова: вакцины, иммунные сыворотки, иммуноглобулины, аллергены, диагностикумы, бактериофаги.