2.4. Зрелые биоплёнки.
После окончания аггрегации клеток микроорганизмов в микроколонии наступает стадия созревания биоплёнки. Длительность процесса созревания может значительно варьировать в зависимости от различных факторов, таких как природа микроорганизмов образующих биоплёнку, доступность источников основных биогенных элементов, тип поверхности на которой образуется биоплёнка и т.д.
В процессе созревания можно выделить две основные стадии: синтез компонентов матрикса биоплёнки и формирование архитектуры биоплёнки. Синтез компонентов матрикса может начинаться на достаточно ранних этапах формирования биоплёнки. Так, у P. aeruginosa стадия созревания биоплёнки открывается началом синтеза альгината в первичных микроколониях. В условиях эксперимента синтез альгината можно зарегистрировать уже через 3-3,5 часа с момента контакта клеток с субстратом (рис. 10), что может свидетельствовать о ключевой роли этого полисахарида в процессе созревания биоплёнки. Но, на сегодняшний день не существует прямых данных о том, что нарушение синтеза альгината связанно с нарушениями в структуре биоплёнки [5].
Рис. 10. Зрелые микроколонии P. aeruginosa PA01на поверхности предметного стекла через 3,5 часа после начала инкубации. Начавшееся накопление компонентов матрикса биоплёнки скрывает клеточную структуру микроколоний от наблюдения и микроколонии выглядят как интенсивно окрашенные гомогенные образования. (светлопольная микроскопия, окраска кристаллическим фиолетовым)*
Показано, что транскрипция гена algC у P. aeruginosa начинается практически сразу после прикрепления клеток к субстрату [6]. При этом начало биосинтеза альгината приводит к негативной регуляции синтеза компонентов жгутика [15]. Это подтверждается тем фактом, что выделяемые от больных муковисцидозом штаммы P. aeruginosa (муковисцидоз часто сопровождается формированием биоплёнки P. aeruginosa на поверхности лёгких) относятся к мукоидным штаммам, однако не подвижны. Такие штаммы характеризуются мутацией в гене mucA, которая обуславливает повышенное накопление сигма фактора 22 (σ22), который кодируется геном algT [14]. Инактивация algT приводит к восстановлению биосинтеза компонентов жгутика, а следовательно и восстановлению движения. Таким образом, можно предполагать, что σ22 является одним из основных регуляторов обеспечивающих переключение между двумя основными жизненными формами у P. aeruginosa – подвижной свободноживущей и не подвижной прикреплённой [5]. Однако, такая связь между ингибированием синтеза компонентов жгутика и индукцией синтеза компонентов матрикса характерна не для всех подвижных бактерий. Так, у Vibrio parahaemolyticus прикрепление к субстрату и начало синтеза компонентов матрикса не вызывает ингибирование синтеза компонентов жгутика. Контакт между клетками у этого микроорганизма приводит к изменению в сигнальных каскадах и переключению механики работы жгутика на осуществление swarming motility [25].
Второй важнейшей стадией в процессе созревания биоплёнки является образования сложной архитектуры. Принципы регуляции этого процесса достаточно многогранны и включают в себя значительное количество механизмов.
Важную роль в формировании архитектуры биоплёнки играет межклеточная коммуникация у микроорганизмов, которая будет подробно рассмотрена в главе 4. Так, было показано, что мутанты P. aeruginosa не способные синтезировать сигнальные молекулы, а, следовательно, осуществлять межклеточную коммуникацию, имеют те или иные дефекты в строении биоплёнки. P. aeruginosa дикого типа формирует хорошо структурированные микроколонии толщиной более 100 мкм резистентные к действию 0,2 % раствора додецилсульфата натрия (SDS) [7]. Мутация в гене lasI, которя приводит к нарушению синтеза одной из ключевых сигнальных молекул P. aeruginosa – 3-оксо-додеканоил гомосерин лактона, нарушает так же и нормальное развитие биоплёнки этого микроорганизма. Такие мутанты формируют тонкую (около 20 мкм) диффузную биоплёнку дифференцировка которой по-видимому прекращается ещё на стадии монослоя. При этом полностью пропадает резистентность к действию SDS [7].
Ключевую роль в образовании архитектуры биоплёнки так же играет матрикс. Нарушение биосинтеза некоторых компонентов матрикса приводит и к нарушению архитектуры биоплёнки. Так, у E.coli штаммы, не синтезирующие колановую кислоту, не способны формировать биоплёнку со сложной архитектурой [3]. У этих штаммов не наблюдается нарушения адгезии, что свидетельствует об отсутствии связи между синтезом колановой кислоты и этим процессом. Более того, такие штаммы формируют вполне нормальные микроколонии и нарушения в процессе образования биоплёнки можно обнаружить лишь в ходе её дальнейшей структуризации. Это наводит на мысль о том, что для E.coli колановая кислота не играет роли адгезина или молекулы клеточной коаггрегации [5].
Компоненты матрикса так же важны и для образования нормальной архитектуры биоплёнки Vibrio cholerae. Так же как и P. aeruginosa, холерный вибрион при формировании биоплёнки образует крупные микроколонии разделённые матричными пустотами [38, 41]. Мутантные штаммы V. cholerae c нарушениями в синтезе компонентов матрикса, в частности ЭПС не способны формировать типичную архитектуру. Это, по-видимому, связанно с нарушением стабильности биоплёнки [38]. С другой стороны, было показано, что для штаммов V. cholerae характерна значительная гетерогенность в уровне синтеза ЭПС, которая, в свою очередь, влияет на архитектуру формирующейся биоплёнки [41]. Так, штаммы холерного вибриона которые без каких-либо искусственных изменений в геноме синтезируют малое количество ЭПС, формируют биоплёнки с отличной от нормальной архитектурой. При этом наблюдается явление спонтанного повышения такими штаммами уровня синтеза ЭПС и формирование биоплёнки с нормальной архитектурой, с последующим возвратом к исходному варианту [28, 41]. На сегодня не известно, является ли это следствием фазовых вариаций, случайных мутаций или каких-то других, не описанных пока явлений. Yildiz и Schoolnik предположили, что подобное явление может быть механизмом обеспечивающим выживание таких штаммов V. cholerae во внешней среде, следовательно, если данная гипотеза верна, можно смело говорить о том, что у V. cholera процесс формирования биоплёнки in vivo и in vitro регулируется принципиально разными механизмами [5].
В лабораторных условиях процесс полного созревания биоплёнки занимает в среднем 24-48 часов. В дальнейшем, в течение всего срока жизни, в биоплёнках практически не наблюдается серьёзных структурных перестроек вплоть до того пока они не входят в финальную стадию своего жизненного цикла – стадию распада. Однако в это время значительно повышается их функциональная активность.