4.4. Система мессенджеров
Описанные выше типы систем QS у микроорганизмов представляют собой по сути системы клеточной сигнализации. Однако кроме неё существуют и другие такие системы. Они основаны на использовании специфических соединений получивших названия мессенджеры. Мессенджеры используются живыми организмами для передачи различных сигналов и формирования ответа на них. У экариот, включая низших, роль мессенджеров выполняют метаболиты арахидоновой кислоты – простагландины, тромбоксаны и лейкотриены, а так же различные соединения, включая оксид азота диацилглицерол, инозитолтрифосфат, фосфатидилинозитолы и др. Однако, все эти соединения отсутствуют у бактерий. У них, роль мессенджеров выполняют некоторые цикличиские нуклиотиды, первое место среди которых занимает бис-(3’-5’)-циклический-ди-гуанизин-монофосфат (цикло-ди-ГМФ).
Цикло-ди-ГМФ (рис. 27) был впервые описан при изучении синтеза целлюлозы у Gluconacetobacter xylinus [69]. Биохимические исследования показали, что данное вещество является аллостерическим регулятором мемабранно-связанного целлюлозо-синтазного комплекса у этого микроорганизма. Уровень данного вещества в клетках G. xylinus контролируется двумя противоположными типами активности – нуклиотидциклазной, для повышения уровня цикло-ди-ГМФ и фосфодиэстеразной, для снижения уровня этого вещества. В дополнении к двум предыдущим типам активности, которые осуществляются с помощью специфических белков, существует также цикло-ди-ГМФ-связывающий белок. Все три белка являются мембранно-связанными и входят состав целлюлозо-синтазного комплекса[42, 68]. Исследования показали, что у
Рис. 27. Структурная формула бис-(3’-5’)-циклический-ди-гуанизин-монофосфата
G. xylinus компоненты системы цикло-ди-ГМФ представлены в общем шестью белками, которые кодируются тремя генами pde, и тремя генами dgc [77]. Каждый из этих белков содержит домены состоящий из трёх аминокислотных остатков: GGDEF, EAL и PAS. Первый домен проявляет циклазную активность, второй, повидимому, является фосфодиэстеразной [27, 58]. Подобное связывание двух типов активности в приделах одного фермента, видимо является следствием эвалюционных изменений, направленных на улучшение контроля уровня цикло-ди-ГМФ в клетках G. xylinus. PAS домен представляет собой кислородный сенсор, коферментом которого является гемин [14].
Биосинтез цикло-ди-ГМФ осуществляется из двух молекул ГТФ (рис. 28). Этот процесс протикает в две стадии с образованием в качестве интермедиата pppGpG и высвобождением молекул пирофосфата, который быстро гидролизуется с образованием фосфата неорганического. Разрушение цикло-ди-ГМФ с образованием двух молекул 5’ ГМФ так же является двухстадийным процессом с образованием в качестве промежуточного продукта линейного нуклиотида pGpG [68].
Рис. 28. Метаболизм цикло-ди-ГМФ.
Кроме регуляции активности ферментных комплексов цикло-ди-ГМФ играет важнейшую роль в процессе формирования биоплёнки, регулируя переход между двумя основными жизненными формами микроорганизмов – свободноживущей подвижной и прикреплённой [18]. Так, GGDEF был впервые идентефицирован в белке PleD, который выполняет функцию регулятора такого перехода у Caulobacter crescentus [1, 31]. Подобное можно наблюдать и у многих других микроорганизмов. Так, было показано, что у Vibrio parahaemolyticus повышение уровня цикло-ди-ГМФ приводит к прекращению swarming motility и индукции процесса образования биоплёнки [24, 38, 67]. У этого микроорганизма гены scrABC и scrG (регуляторы swarming motility и капсульных полисахаридов) которые впервые были описаны как регуляторы генов семейства laf в условиях роста в суспензионной культуре (когда гены laf репрессированы) меняют профиль своей биологической активности, и осуществляют обратную регуляцию swarming motility и процесса формирования биоплёнки путём изменения уровня цикло-ди-ГМФ. В scrABC опероне ген scrA кодирует пиридоксал-фосфат зависимый фермент, scrB – экстраклеточный белок связывающий растворенные компоненты среды, а sarC – белок осуществляющий связывание между собой GGDEF и EAL домены в один полипептид [7, 24]. Ген scrG кодирует белок имеющий в своём составе PAS-домен и образующий внеклеточный модуль для GGDEF-SarC-EAL полипептида. Нуль мутанты по генам scrABC и scrG характеризуются подавленной экспрессией генов laf, однако, повышенной экспрессией генов cps [25]. У таких мутантов также наблюдается полное блокирование swarming motility, на фоне резкого усиления способности к формированию биоплёнки. Инактивация обоих генов приводит к ещё большему усилению выше описанных эффектов, что сведетельствует о кумулятивном влиянии scrABC и scrG на уровень экспрессии laf и cps. Однако, даже у scrABC-- scrG- мутантов не наблюдается нарушений в работе жгутиков или биосинтезе их компонентов, а так же нарушений самого процесса swarming motility, что сведетельствует об отсутствии прямой связи между означенными генами и движением у V. parahaemolyticus [7, 41].
У P. aeruginosa имеются два мембранносвязанных белках SadC и BifA. Первый является нуклеотидциклазой а второй фосфотидилэстеразой. Нуль мутанты по первому белку теряют способность к формированию биоплёнки, тогда как инактивация гена bifA приводит к потере способности клеток P. aeruginosa двигаться по твёрдым поверхностям. Исследования, проведённые на этих группах мутантов, позволили выявить цитоплазматический белок SadB, который регулирует работу жгутиков, в зависимости от степени вязкости среды и связанный с так называемой хемотаксис IV кластерной системой [44]. Мутанты по этому белку теряют способность к swarming motility, а так же отвечать на изменения вязкости среды. У таких мутантов наблюдается резкое возрастание уровня активности SadC и значительно более высокий уровень цикло-ди-ГМФ в сравнении с диким типом. Таким образом, три описанных выше белка являются регуляторами хемотаксис-подобной системы, которая в зависимости от изменения условий внешней среды осуществляет переход между основными формами существования у P. aeruginosa [44].
Известно ряд случаев, когда цикло-ди-ГМФ напрямую вовлекается в процесс межклеточной коммуникации у бактерий. Так, у Myxococcus xanthus было показано, что это соединение может выступать в роли межклеточного сигнала. Регулятор ответа ActA M. xanthus, относящийся к GGDEF-типу регулирует биосинтез так назывемого С-сигнала, поверхностного белка, который регулирует агрегацию клеток этого микроорганизма в плодовые тела [7].
Система, основанная на регляции уровня цикло-ди-ГМФ является достаточно чувствительной и способна реагировать на досточно значительное количество входящих сигналов (рис. 29). При этом одни сигналы обеспечивают повышение уровня этого мессенджера, а другие снижение. Так, входящими сигналами, которые активируют белки содержащие GGDEF-домен и преводящие к повышению уровня цикло-ди-ГМФ могут служить: облучение видимым светом, связывание ионов (гемиритрин, катион-связывающие белки), связывание фосфотиранина\фосфотиразина (FHA, «вилочный домен»), связывание газообразных молекул (PAS/PAC, Per (periodic clock protein), Arnt (Ah receptor nuclear translocator protein), связывание ДНК (HTH–LUXR, helix–turn–helix, Lux-регулон). Активация EAL-домена и снижение уровня мессенджера вызывается связыванием фосфатов (HisKA, histidine kinase A),
Рис. 29. Входящие сигналы, вызывающие колебания уровня цикло-ди-ГМФ и эффекты, вызываемые этими колебаниями.
связыванием белков и пептидов (TRP, CBS, домен в цистатионин бета-синтазе), связыванием аминокислот (PBPb, бактериальный переплазматический субстрат-связывающий белок), связыванием сахаров (7TMR-DISMED2, 7TM рецептор с внутриклеточным сигнальным модулем), связыванием нуклиотидов\нуклиозидов (домен фоторецептора бактерий, cNMP) [67].