4.3. Типы систем quorum sensing

Широкое разнообразие сигнальных молекул накладывает свой отпечаток на организацию и функционирование системы QS. С точки зрения структурно-функциональной организации на сегодня выделяют два основных типа систем QS – систему аутоиндукции и систему сигнальной трансдукции [16, 26].

Система аутоиндукции является основным типом системы QS у грамотрицательных бактерий. В качестве сигнальных молекул в ней используются АГЛ. Система аутоиндукции (рис. 21) состоит из двух типов

Рис. 21. Схема функционирования системы аутоиндукции.

белков – I и R. I-белок представляет собой АГЛ-синтетазу (ацетилфосфат трансферазу), который отвечает за синтез сигнальных молекул. R-белок является рецептором для АГЛ. Эти белки относятся к Lux-семейству, названному так в связи с их первичным обнаружением в качестве регуляторов биолюминисценции у V. fisheri [86]. Система аутоиндукции функционирует следующим образом. Синтезированные с помощью I-белка сигнальные молекулы выводятся из клеток путём диффузии и накапливаются во внешней среде. По достижению определённой пороговой концентрации молекулы АГЛ поступают обратно в клетки (так же с помощью диффузии) и связываются с R-белками. R-белки относятся к классу внутриклеточных рецепторов, которые, связываясь со своими лигандами (АГЛ) приобретают функциональную активность. Связывание АГЛ с рецепторами приводит к образованию АГЛ-R комплексов, которые мултимеризуються за счёт дополнительного взаимодействия между ацильными хвостами сигнальных молекул. Образующиеся мультимерные комплексы n(АГЛ-R) обладают полимеразной активность и обуславливают экспрессию генов-мишеней. Среди генов-мишеней комплексы n(АГЛ-R) индуцируют экспрессию генов кодирующих І и R, поддерживая накопление новых АГЛ и рецепторов к ним, то есть аутоиндуцируют работу системы QS [84]. Примером системы основанной на принципе аутоиндукции является система QS у P. aeruginosa.

У P. aeruginosa роль сигнальных молекул выполняют два АГЛ – 3-оксо-додеканоил гомосерин лактон и N-бутирил-гомосерин лактон, а так же упоминавшийся выше PQS. Гены системы QS у этого микроорганизма представлены тремя группами – las, rhl, и pqs [32, 83]. Каждая из этих групп генов обеспечивает синтез и ответ на свою сигнальную молекулу.

В инактивированном состоянии система QS у P. aeruginosa находится под негативным контролем трёх белков репрессоров - RsmA, RpoS и QscR, которые предупреждают раннюю активацию [17, 60, 82]. На ранних этапах активации системы в клетках накапливается гуанизин-3’,5’-бисфосфат (ppGpp) который синтезируется с помощью белка RelA [80]. Накопление этого продукта приводит с одной стороны к инактивации белков репрессоров, а с другой к активации ранних регуляторных генов, таких как mvaT. Продукт этого гена, в свою очередь, активирует синтез белка Vfr [22]. Vfr является непосредственным активатором системы QS у P. aeruginosa. Работа системы начинается с активации las-звена (рис. 22). Vfr индуцирует гены lasI (3-оксо-додеканоил-гомосерин лактон) и lasR (рецептор). Это сопровождается повышением

Рис. 22 Система QS у P. aeruginosa.

концентрации 3-оксо-С₁₂-АГЛ, и по достижении определённого порогового уровня он начинает связываться со своим рецептором. Получившийся комплекс активирует гены las-, а также rhl- и pqs-. Активация rhl- и pqs- приводит к появлению N-C₄-АГЛ и PQS, а так же рецепторов к ним. Далее система переходит в самоподдерживающееся состояние и начинается экспрессия генов-мишеней. las- звено системы QS P. aeruginosa контролирует биосинтез эластазы (ген lasB), Las-протеазы (ген lasА), токсина А (ген toxA), лектинов (lecA, lecB), сидерофоров и др. rhl-звено контролирует синтез рамнолипидов (rhlABC), НСN, пиоцианина (phnA, phnB) и др. pqs-звено выполняет функцию переключателя между предыдущими двумя звеньями, а так же выполняет функцию дополнительного контроля биосинтеза выше описанных продуктов [49].

Таким образом, система QS у P. aeruginosa основана на использование нескольких последовательно появляющихся сигнальных молекул. Последние данные указывают на то, что роль сигнальной молекулы так же выполняет пиоцианин [45]. Так, исследования показали, что пиоцианин способен активировать фактор транскрипции SoxR и тем самым осуществлять положительную регуляцию mexGHI-opmD (efflux) и моноксигеназы с неизвестной функцией (ген PA2274) [61]. Поскольку, по сегодняшним представлениям пиоцианин не вызывает появление сигнальных молекул более низкого порядка, а лишь вызывает опосредованную эксприессию некоторых генов, это вещество можно считать терминальным сигналом системы QS у P. aeruginosa [45].

Система сигнальной трансдукции, характерная для грамположительных микроорганизмов характеризуется более сложной структурной организацией, чем система аутоиндукции (рис. 23). В качестве сигнальных молекул в данной системе используются пептиды. Работа системы сигнальной трансдукции кардинально отличается от предыдущей.

Рис. 23. Принципы функционирования системы сигнальной трансдукции.

Как указывалось выше, биосинтез сигнальных пептидов происходит с общей матрицы в виде полипептида. Процессинг молекулы полипептида у большенства микроорганизмов осуществляется в момент выхода этих молекул из клетки. В отличии от АГЛ грамотрицательных бактерий, этот полипептид из-за своих размеров не способен к диффузии и его выведение из клетки осуществляется с помощью механизмов активного транспорта. Транспорт синтезированного полипетида осуществляется с помощью сложного АТФ-зависимого кассетного транспортёра. Этот транспортёр содержит как минимум три функциональных домена: домен А представляет собой канал, через который проходит молекула полипептида; домен В – АТФ-аза, обеспечивающая функционирование транспортёра и домен С – пептидазный домен, который осуществляет процессинг полипептидной цепи. Таким образом, в межклеточном пространстве накапливаются молекулы сигнальных пептидов. При достижении пороговой концентрации сигнальные пептиды, в отличии от АГЛ, не поступают внутрь клеток микроорганизмов, а связываются со специфическими рецепторами на поверхности клеток микроорганизмов. Эти рецепторы через трансмембранный домен ассоциированы с сенсорными киназами (обычно гистидин киназой). Связывание сигнального пептида с рецептором приводит к активации сенсорной киназы, которая фосфорилирует белок-регулятор. Активированный белок-регулятор приобретает полимеразную активность и активирует экспрессию генов-мишеней [33, 75]. Примером системы, основанной на принципе сигнальной трансдукции, является система QS у бактерий рода Staphylococcus.

Компоненты системы QS у бактерий рода Staphylococcus кодируются agr локусом [65]. Экспрессия данного локуса находится под контролем двух различных промоторов, P2 и P3. Под контролем промотора Р2 находится 4-х генный оперон, который составляет основу системы QS: agr A-D. Продукты этих генов распределяются следующим образом:

1. agrA – ген, который кодирует регулятор ответа

2. agrB – ген, который кодирует компоненты АТФ-зависимого кассетного транспортёра\экзопептидазы

3. agrC – ген, который кодирует гистидин киназу

4. agrD – ген, кодирующий предшественник сигнальных пептидов

Предшественник сигнальных пептидов поддаётся процессингу как с N- так и С- конца с образованием тиолактона между центральным цистеином и С-концом сигнального пептида [48]. AgrB представляет собой трансмембранную экзопептидазу и играет ключевую роль в образовании сигнальных пептидов [62]. AgrD связывается с мембраной за счёт своего N-конца, тогда как взаимодействие с AgrB осуществляется с помощью С-конца молекулы-предшественника [87]. При этом происходит разрыв молекулы с С-конца при участии видоизмененных остатков гистидина и цистеина, которые впоследствии катализируют образование тиолактонного кольца [62]. Процессинг N-терминального конца осуществляется с помощью сигнальной протеазы SpsB [40].

AgrC является характерным представителем класса 10 рецептоных гистидин киназ [30]. Белок содержит два домена: N-концевой трансмембранный сенсорный домен, и С-концевой цитоплазматический киназный домен. При этом С-концивой домен является крайне консервативным, тогда как N-концевой домен, который содержит детерминанты специфичности – очень вариабельным [46, 85]. Однако исследования многочисленных agr-мутантов показало, что за нормальное функционирование рецепторного домена отвечает лишь не большое число аминокислотных остатков. Эти аминокислотные остатки, особенно находящиеся в позиции 100-116 повидимому и обуславливают связывание специфических лигандов [65].

Цитоплазматический киназный домен AgrC является димером в котором мономеры соедененны промижуточной областью из 6 аминокислотных остатков. Домен подвергается транс-аутофосфориллированию в процессе переноса фосфата на белок-эффектор и, таким образом, не отличается от большенства бактериальных гистидин-протеинкиназ [11]. Как указывалось выше, для киназного домена характерна высокая консервативность. Практически любые мутации как в структуре киназного домена так и в структуре белка- эффектора ведут к стойкому снижению эффективности переноса фосфата, в связи с нарушением комплиментарности [65].

Белок-эффектор AgrA является ярким примером бактериального регулятора ответа. Этот белок обладает способностью к высокоаффинному связыванию с agr-промотором [43]. Добавление высоко-энергитического донора фосфатов улучшает подобное связывание. Это сведетельствует о том, что AgrA является функционально активным лишь в фосфориллированной форме. При этом, AgrA приемушественно связывается с P2 промотором, образуя более сильную и стабильную связь, чем с Р3 [43]. Исходя из этого, можно предположить, что активация Р2 предшествует активации Р3 промотора [15]. Сайтом узнавания и связывания для активированного AgrA являются гептануклиотидные повторы в последовательности промоторов. Подобное характерно и для белков-эффекторов других грамположительных бактерий [20, 66]. У S. aureus AgrA часто взаимодействует с другим регуляторным белком – SarA, который так же связывается с Р2 промотором. Такое взаимодействие, повидимому, приводит к совершенствованию экспрессии как Р2 так и Р3 промоторов [53, 63].

Кроме AgrA, роль эффектора agr системы QS у бактерий рода Staphylococcus выполняет короткая РНК состояшая из 514 нуклиотидов – РНК ІІІ [55]. Она представляет собой регуляторную РНК со сложной вторичной структурой (рис. 24), и временем жизни более 45 минут [5]. Она кодирует амфифильный пептид, состоящий из 26 аминокислот, который

Рис. 24. Вторичная структура РНК ІІІ [65].

является δ-гемолизином и не выполняет регуляторных функций, однако является важным фактором клеточной коаггрегации и созревания биоплёнки [37, 65].

Интересным является то, что среди бактерий рода Staphylococcus наблюдаются некоторые вариации в последовательности нуклиотидов в РНК ІІІ, однако сохроняется неизменность в организации вторичной структуры, результатом чего является кросс-реактивность между видами [79].

Функции РНК ІІІ достаточно разнообразны. 3’-конец молекулы является репрессором биосинтеза белка А (sap) [5]. Не перекрытые субрегионы на 5’ и 3’ концах РНК III способны регулировать транскрипцию генов α-гемолизина (hla) [55]. Таким образом, первичная и единственная функция РНК III в качистве регуляторной молекулы, это регуляция трансляции индивидуальных экзобелков и плеотропных регуляторов. Так, позитивная регуляция биосинтеза α-гемолизина этой молекулой осуществляется путём противодействия блокированию считывания hla мРНК, но при этом сама является ингибитором трансляции белка А и фибрин-связывающего белка, который кодируется геном SA1000, путём перекрывания регионов инициации трансляции в мРНК обоих белков [52, 55]. Так же показано, что РНК III с помощью того же механизма способна ингибировать трансляцию Rot-регулятора [28]. Между РНК III и rot мРНК возникают как минимум два контакта по принципу «петля-петля», причём, в месте одного из них происходит интеграция петли РНК III в последовательность rot мРНК, что приводит к блокированию связывания rot мРНК с рибосомой [6]. Последнее событие (ингибирование биосинтеза Rot-регулятора) приводит к выключению agr системы QS, но так как agr и rot перекрываются лишь частично, по-видимому, должен существовать ещё один, не описанный пока белок-регулятор, который в случае ингибирования синтеза Rot способен осуществлять негативную регуляцию генов agr [70].

Так же как и в случае системы QS у P. aeruginosa, под контролем agr у бактерий рода Staphylococcus находится достаточно значительное количество продуктов и признаков. Сюда входит синтез факторов патогенности, вторичных метаболитов, различных поверхностных и экзобелков, образование биоплёнки и многое другое. В дополнении к agr системе QS, у бактерий рода Staphylococcus, как и у многих других грамположительных бактерий существует система, основанная на использовании АИ-2, которая будет описана ниже.

Системы аутоиндукции и сигнальной трансдукции являются базовыми системами коммуникации у бактерий. Однако значительная разница в строении и принципах функционирования этих двух систем не позволяет использовать их для межгрупповой коммуникации. Межгрупповая коммуникация у бактерий осуществляется за счёт наличия дополнительной, построенной на использовании АИ-2 системе QS.

Как было описано выше, под понятием АИ-2 сегодня подразумевают два родственных соединения, различные по своей химической структуре [74]. Эти различия накладывают свой отпечаток на принцип функуионирования системы QS, основанной на использовании АИ-2. Сегодня выделяют три типа структурно-функциональной организации таких систем, которые сочетают в себе черты как системы аутиоиндукции, так и системы сигнальной трансдукции:

1. АИ-2-QS cистема бактерий семейства Enterobacteriaceae – в качестве сигнальной молекулы используется 2,2,6,6а-тетрагидрокси-3а-фуранон.

2. АИ-2-QS система бактерий сеймейства Vibrionaceae – в качестве сигнальной молекулы используется фуранозил борат диэстер.

3. «Двухкаскадная» система QS у V. harveyi – для регуляции экспрессии генов одновременно используются фуранозил борат диэстер и гомосерин лактоны.

Примером системы первого типа является система QS у бактерий рода Salmonella (рис. 25). Она представлена генами симейства lrs. В это семейство входят гены которые кодируют сложный трансмембранный АВС транспортёр (lrsА, lrsВ, lrsС), ген lrsК, кодирующий киназу, lrsR, который кодирует белок-регулятор ответа и lrsI, ответственный за биосинтез АИ-2 [76]. Синтезированные молекулы АИ-2 свободно диффундируют через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерий и по достяжении определённой концентрации связываются с LrsВ, который является рецепторным доменом АВС транспортёра. Это связывание приводит к тому, что LrsА изменяет свою конформацию, заставляя LsrC

Рис. 25. Системы QS основанные на использовании аутоиндуктора-2.

открыть трансмембранный канал. По этому каналу молекулы аутоиндуктора 2 попадают внутрь клетки бактерий и связываются с киназой LsrK, которая фосфориллирует сигнальные молекулы. Данное событие необходимо для их активации. Активированные таким образом АИ-2 связываются с LsrR, который преобретает полимеразную активность и активирует экспрессию генов мишеней [76].

У бактерий рода Vibrio АИ-2-QS система функционирует иначе (рис. 25). У этих бактерий гены системы QS составляют симейство lux [86]. Синтезированный с помощью LuxS АИ-2 диффундирует из клеток микроорганизмов. При достяжении клетками определённой численности, АИ-2 связывается со специфическим рецептором на поверхности клетки, который ассоциирован с киназой\фосфотазой LuxQ. В отсутствии АИ-2 LuxQ проявляет киназную активность и фосфориллирует белки LuxU и LuxО, которые в фосфориллированном состоянии являются ингибиторами экспрессии LuxR-полимеразы. Связывание АИ-2 на поверхности клеток приводит к тому, что LuxQ изменяет свою конформацию. Это приводит к изменению активности этого фермента с киназной на фосфотазную и дефосфориллированию LuxU и LuxО, которые при этом теряют свои репрессорные свойства и индуцируют биосинтез LuxR. Накопление последнего и обуславливает активацию генов мешеней.

«Двухкаскадная» система QS у V. harveyi (рис. 26) устроена более сложно [4]. Эта система в своей структуре объединяет систему аутоиндукции грамотрицательных бактерий и второй тип организации АИ-2-QS системы. В клетках V. harveyi одновременно

Рис. 26. Система QS у V. harveyi.

синтезируются АИ-2 в виде фуранозил борат диэстера и гомосерин лактоны. АИ-2, как было описано выше, индуцирует биосинтез LuxR, которая у этого микроорганизма в отличие от других членов симейства не проявляет полимеразных свойств. Полимеразные свойства этот белок пребретает только после связывания с гомосерин лактонами, которые свободно диффундируют из окружающей среды в клетки V. harveyi.