2 Материал и методы исследования

Работа проводилась в июне–июле и в сентябре 2014 года в баклаборатории Краснодарской краевой больнице №2.

Все исследования проведены согласно методическим указаниям МУК 4.2.1890-04 (Определение чувствительности к антибактериальным препаратам от 4 марта 2004 года) и «Практическому руководству по клинической микробиологии и антимикробной терапии для врачей стационарной помощи» Зубкова, 2002.

2.1 Объект исследования

Объектом исследования служили моча и отделяемое цервикального канала больных урологического отделения. Всего было проанализировано 722 пробы, содержащих штаммы Enterobacteriaceae (708 проб мочи и 14 проб из цервикального канала). От пациентов других отделений были взяты на исследование кровь, ликвор, пунктаты, моча и раневое отделяемое.

2.2 Среды для культивирования микроорганизмов

- Среда Уриселект 4 - неселективная среда для изолирования и подсчета микроорганизмов из мочевого тракта; прямой идентификации E. coli (розовые колонии), Enterococcus (синие колонии), Proteus (коричневые колонии); предварительной идентификации KES-группы (Klebsiella, Enterobacter, Serratia). Позволяет через 18 ч после посева идентифицировать до 80% изолятов [Зубков, 2002].

- Питательные среды для посева мочи и отделяемого ц/к.

- Кровяной агар. К 100 мл расплавленного сухого питательного агара, производства компании «Biomerieux», Франция, добавляли 5 мл дефибринированной крови человека [Зубков, 2002].

- Мак–Конки среды (А. Т. Mac Conkey) – дифференциально-диагности-ческие среды, применяемые для обнаружения и выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизентерийных бактерий из различных материалов. Колонии кишечной палочки на агаре Мак-Конки ярко-красного цвета [Зубков, 2002].

- Олькеницкого среда (трехсахарная среда с мочевиной). Готовая среда имеет бледно-розовый цвет. Применяют для накопления и дифференциации Enterobacteriaceae. Позволяет определить у исследуемой культуры ферментацию углеводов, мочевины, образование сероводорода [Зубков, 2002].

- Среда Симмонса. Эта среда используется для дифференциации представителей сем. Enterobacteriaceae по способности использовать цитрат в качестве единственного источника углерода. Ассимилирующие цитрат культуры дают рост и изменяют цвет среды на синий, не ассимилирующие цитрат - не дают роста и не меняют цвета среды [Зубков, 2002].

- Среда Кларка - жидкая дифференциально-диагностическая питательная среда для определения у микроорганизмов интенсивности кислотообразования при расщеплении глюкозы и способности продуцировать ацетилметилкарбинол; содержит пептон, глюкозу, гидрофосфат калия и индикатор. Добавление индикатора метилового красного к культурам Escherichia coli приводит к появлению красного окрашивания ввиду сильного закисления среды в результате ферментации глюкозы [Зубков, 2002].

2.3 Выделение Enterobacteriaceae из исследуемого материала

Этот этап заключается в изучении характера роста на питательной среде, интерпретации визуальной характеристики выросших колоний и отборе их для получения чистой культуры и первичной идентификации. Учитывают прежде всего морфологическую характеристику колоний, пигментообразование, наличие специфического запаха (например, у бактерий рода Citrobacter), изменение цвета среды. Ведущее значение имеет дифференциация по окраске изолированных колоний, которую определяют особенности метаболизма бактерий в отношении дифференцирующих субстратов питательной среды. Таким субстратом в большинстве случаев является лактоза. Соответственно и колонии, образованные бактериями, не расщепляющими ее, выглядят бесцветными или имеющие оттенок цвета самой среды. Такие колонии подлежат первоочередному отбору (отсеву), так как могут быть образованы патогенными энтеробактериями (шигеллами, сальмонеллами и т.д.) и условно-патогенные энтеробактерии (УПЭ) (гафния, провиденция, серрация и др.) Многие штаммы УПЭ способны ферментировать лактозу с различной интенсивностью и образуют разной степени окрашенные колонии. Поэтому для дальнейшего изучения следует отсевать не менее 3-5 колоний каждого вида, особенно при первичной этиологической расшифровки диарейных заболеваний в очагах [Гиссенс, 2001].

Методика взятия колоний для выделения чистой культуры проста, но имеет большое значение. Дело в том, что используемые питательные среды (особенно высоко селективные) действуют в основном бактериостатически и микробы-спутники, не развиваясь на них, сохраняют жизнеспособность, а значит представляют опасность загрязнения колоний искомых энтеробактерий. Колонию следует снимать тонкой бактериологической петлей прикосновением к центру колоний. Недопустимо охлаждение петли о визуально свободную от роста поверхность среды. Отобранные колонии отсевают на многотестовые (комбинированные) среды для накопле­ния чистой культуры и ее предварительной идентификации [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].