2.4 Методы идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae

Со среды Эндо снимают подозрительные колонии и засевают уколом в столбик среды Олькеницкого. После 24-часовой инкубации при 37ºC делают предварительное заключение о родовой принадлежности выделенных культур [Зубков, 2002].

На поверхности среды Олькеницкого наблюдается влажный однородный рост без пигментообразования. По изменению окраски столбика среды учитывают способность ферментировать глюкозу, а по изменению окраски скошенной части ферментировать лактозу. Для определения родовой принадлежности проводят:

- Определение подвижности в полужидкой среде Кларка. При росте микроорганизмов по ходу укола судят об отсутствии подвижности;

- Определение использования цитрата.

Посев производят 18-часовой культуры на среду Симмонса. Инкубируют при 37ºC 18–20 часов. Рост культуры и изменение окраски в синий цвет свидетельствуют о положительной реакции. Кишечная палочка в отличие от других кишечных бактерий роста не дает;

- Определение декарбоксилаз аминокислот. Посев производят в среду с аминокислотами (лизин, орнитин, аргинин) и контрольную среду, вносят стерильное вазелиновое масло, инкубируют при 37ºC 24 часа. Затем добавляют 4–5 капель 10% раствора хлорида железа (3). Появление интенсивно-зеленой окраски свидетельствует о положительной реакции;

- Видовая дифференциация на среде Гисса по реакциям «пестрого ряда» [Зубков, 2002].

Также идентификация микроорганизмов проводилась при помощи времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI). Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ — (от англ. MALDI, Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization) — десорбционный метод«мягкой» ионизации, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Матрица представляет собой материал, свойства которого обусловливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и ионизацию анализируемого вещества. В баклаборатории ГБУЗ ККБ№ используют метод МАЛДИ масс-спектрометрии по белковому профилю бактерий [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

2.5 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотическим препаратам

В лабораториях лечебных учреждений чаще применяется диско-диффузионный метод (ДДМ) определения чувствительности, основанный на способности антибактериального препарата диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара.

Для определения чувствительности ДДМ используют плотную питательную среду и стандартизированные диски, изготовленные в специализированных лабораториях. При измерении зон задержки роста ориентируются на зону полного подавления видимого роста [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

Помимо ДДМ чувствительность микроорганизмов определяют при помощи система для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact, в основу которой положен метод серийных разведений. Автомат производит разведение культуры бактерий и засевает им специальные кассеты с уже нанесенными антибиотиками. После 7-8 часов инкубации при 37ºC аппарат передает данные в компьютер в виде таблицы, на которой отображается устойчивость антибиотикам [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

Для определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом применялись диски, производства НИЦФ, Санкт-Петербург, компании Biomerieux, Becton Dikinson, Франция, диски с нитроцефепином для определения наличия бета-лактамаз производства Челябинского НИИИФ. Для идентификации микроорганизмов используется также система для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact производства компании «Био-мерье», Франция [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

Список антибиотиков, применяемых при ручном методе определения чувствительности [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004]:

Антибиотик	Группа
левофлоксацин	фторхинолоны
моксифлоксацин	фторхинолоны
ампициллин	пенициллины
нетилмицин	аминогликозиды
азитромицин	макролиды
цефтазидим	цефалоспорины 3

Список антибиотиков, применяемых на системе для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact исключительно для определения устойчивости штаммов Enterobacteriaceae [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004]:

Антибиотик	Группа
ампициллин	пенициллины
амоксициллин/клавуланат	пенициллины
цефазолин	цефалоспорины 1
цефотаксим	цефалоспорины 3
цефтазидим	цефалоспорины 3
цефепим	цефалоспорины 4
пиперациллин	пенициллины
имипенем	карбапенемы
меропенем	карбапенемы
амикацин	аминогликозиды
гентамицин	аминогликозиды
нетилмицин	аминогликозиды
ципрофлоксацин	фторхинолоны 1
нитрофурантоин	нитрофураны
триметоприм/сульфаметоксазол	диаминопиримидин/сульфаниламид