Литература

• Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – М., 1980

• Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. – М., 2002

Занятие № 4 (лабораторная работа)

ТЕМА: Определение концентрации веществ в многокомпонентной смеси с использованием спектрофотометрии

Цель: Приобрести практические навыки работы на спектрофотометре, измерить характеристики поглощения веществ и определить концентрации веществ в многокомпонентной смеси

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Общая теория поглощения света молекулами, хромофор. Схема энергетических уровней.

2. Спектр поглощения. Задачи абсорбционной спектроскопии, спектры, используемые в области физической биохимии.

3. Спектрофотометр, схема, ход работы, отличие от ФЭКа.

4. Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофора. Эффект рН, полярности и ориентации.

5. Спектрофотометрическое титрование белков.

6. Поглощение поляризованного света.

7. Эмпирические правила интерпретации спектров поглощения биологических макромолекул.

8. Параметры, измеряемые в абсорбционной спектрометрии.

9. Идентификация веществ путем спектральных измерений.

10. «Репортерные» группы.

11. Выполнение практической работы по определению концентрации веществ в многокомпонентной смеси.

Правила работы на спектрофотометре СФ-46:

а) Начинать измерения следует при минимальной ширине щели во избежание засвечивания фотоэлементов спектрофотометра.

б) Открывать крышку кюветного отделения можно только при установленной в положение ЗАКР рукоятке переключения шторки. Снимать показания следует при плотно закрытой крышке кюветного отделения.

в) Перемещать кюветодержатель необходимо осторожно, без рывков, чтобы кюветы сохраняли свое положение на протяжении всего периода измерений.

г) Растворы для исследования должны быть прозрачными, без пузырьков воздуха, способствующих увеличению рассеяния света. Нельзя исследовать холодные растворы, так как на стенках кювет могут конденсироваться пары воды (кюветы запотевают). Кюветы нужно заполнять до такого уровня, чтобы измеряющий световой пучок целиком проходил через слой раствора.

д) Кюветы должны быть чистыми, а их внешние стенки - сухими. Нельзя касаться руками оптических стенок кювет. Капли, царапины и грязь на их поверхности рассеивают, отражают и поглощают свет, что приводит к искажению результатов. Кюветы очень хрупкие, поэтому с ними надо обращаться осторожно, не допускать механических повреждений.

Практическая работа:

Реактивы и оборудование: спектрофотометр СФ-46, стеклянные или пластмассовые кюветы с длиной оптического пути 1 см, растворы рибофлавина (0.1 мМ) и эозина (0.1 мМ) в дистилированной воде, растворы гемоглобина, метгемоглобина (10 мг на 1 мл), тирозина, трипсина, триптофана (2 мг на 1 мл) в буферных растворах рН 7.4 и рН 9.18.

1. Ознакомиться с правилами работы (с помощью преподавателя) на спектрофотометре.

2. Снять спектр гемоглобина (метгемоглобина) от 400 до 650 нм с шагом 5 нм.

3. Снять спектр тирозина (трипсина, триптофана) от 220-310 нм с шагом 5 нм.

4. Построить графики зависимости молярного коэффициента экстинции от длины волны для исследуемых веществ.

5. Проанализировать смесь веществ при двух длинах волн. Выполнение задания на карточке (раздается преподавателем).

Задание по группам

	λ 1	λ 2	Концентрация
1
2
3
4

Длина кюветы = _____

Самостоятельная работа

1. Какие параметры определяют для отождествления измеренного спектра поглощения со спектром какого-либо вещества?