Трансгенные растениия как источник мед препаратов

Пионерские работы - Чарльз Арнцен (хьюстон, техасский университет). Удалось показать, что ген поверхностного белка вируса гепатита В можно эксперссирвоать в клетках табака и белок из табака дает такой же иммунный ответ, как и из вирусных частиц. Можно получать вакцинные препараты из растительного материала. Есть проблемы - очистка требует особых подходов. Часть веществ, которые попадают в препарат - гликозиды и т.д. Сам факт, что для получения вакцины можно не использовать патогены, все должен окупить.

 

Еще одно направление - можно создавать гибридные вирусы, которые несут часть генома растительных вирусов и часть генома вируса человека. Работу сделали совместно англичане и американцы: получили вирус мозаики коровьего гороха, в составе которого были фрагменты gp40 ВИЧ. Таким вирусом заражали растения, его выделяли, вводили в организм белых мышей - появлялись антитела, связывающие ВИЧ. В отношении же противобактериальных вакцин, все ссылаются на работу Арнцена. Использовали ген термолабильного энтеротоксина энтеропатогенных колей. Этот токсин близок к холерному. Эти коли выхывают холероподобное заболевание. Токсин состоит из одной субъединицы А, массой 27 кДа, и 5 одинаковых субъединиц В. Массой 11,6 кДа. На лабораторных животных показано, что иммунитет определяется выработкой антител к субъединице В. Она нужна для присоединения к клеткам кишечника и не токсична. При взаимодействии с ней антител, А не попадает в клетки и не повреждает. Решили выбрать малую субъединицу - лабильный токсин В (LTB). Конструирвоание векторных молекул проходило следующим образом:

 

Фрагмент, состоящий из промотора 35S РНК ВМЦК и примыкающая к нему справа 5 концевая последовательность вируса гравировки табака, далее полилинкер и 3' концевая последовательность гена вспб из сои (сайт терминации и полиаденилирвоания). Это ввели в pUC19 - получили pIBT210. затем с помощью ПЦР синтезировали фрагмент длиной 67 пар нуклеотидов, который отличался от сайта иницации трансляции гена LT-B наличием сайта для рестриктазы NcoI. По этому сайту pIBT210 вставляли ген. Паралельно с этим в плазмиде pJC217 ввели искусственную последовательность - она определяет накопление белка в ЭПР эукариот (SEKDEL) - pLTK217. вырезали из нее кодирующие области генов LT-B и SEKDEL и переклонировали в рbluescript. Оттуда все это перенесли в pIBT210, полученную на первом этапе. Получили pLTB200 и pLTK200. далее из них вырезали структурные части и вставляли в pLTB5 так получили pLTB210 и pLTK 210. далее это перенесли в векторы для агробактериальной трансформации. Только после всего этого ввели это в клетки табака и клетки картофеля. Отбирали по антибиотикорезистентности, ввырастили растения. Определили количество LT-B в листьях табака и клубнях картофеля. На основе связывания с белка с ганглиозидом. Оказалось, что конкретные трансформанты проявляли различный уровень экспрессии, но если в трансформантах, несущих только ген LT-B только 5 мкг на 1г белка, то с SEKDEL - 14мкг. В картофеле - в целом тот же результат. 30 мкг в клубнях , с sekdel - 110мкг. Это оправдало введение этой последовательности, и накопление в ЭПР защищает от протеолиза. Белки очистили и ввели в кровь лаб животных с целью создания иммунитета к эшерихиозу, и это иммунитет возник и более того, когда мышей кормили сырыми клубнями - у них возникал иммунитет.

При варке белок денатурирует. Дальнейшая работа должна была быть перенесена на те, которые можно есть сырыми. В странах третьего мира - колоссальная детская смертность до года из-за этих болезней.

 

Лекция 15

Почему насекомые. Базируется на методах поддержания клеток насекомых в культуре и изученности бакуловирусов. Это ДНК вирусы - достоинство. Они нашли применение в качестве объектов используемых для биологического контроля численности насекомых-вредителей в лесном и сельском хозяйстве. Изучили механизм их репродукции, чтобы их больше нарабатывать. Вирион попадает в клетки эпителия кишечника, транспортируется в ядро и дам раздевается. В ядре происходит репликация ДНК вируса и начинается экспрессия генов, кодирующие белки вирионов и генов, продукты которых обеспечивают образование новых вирусных частиц. Небольшая часть вновь образовавшихся вирионов отшнуровывается от клетки и гемолимфой разностистя по организму насекомого, но большая часть вирионов остается внутри этой клетки и образует компактную структуру, имеющую стенку из белка, который называется полиэдрин. Внутри этой структуры - неактивный вариант вируса. Но в это время активные варианты проходят такой же путь. Образуются скопления вирусов в полиэдриновых оболочках. Длится это 5-7 дней, после чего насекомое погибает. В среднем 10 раундов репликации осуществляется в каждой инфицированной клетке, в теле насекомого доля полиэдриновых частиц - 25% от сухой массы. Эти комплексы после разрушения клеток насекомого не разрушаются и длительное время сохраняются в среде, пока не попадут в другой организм. После съедания, полиэдрин расщепляется протеазами, и вирус высвобождается. ДНК была клонирована в последней четверти 20 века, определены функции основных генов и было установлено, что цикл развития вируса не нарушается, если из генома удалить структурный ген полиэдрина. Промотор гена полиэдрина очень сильный, конститутивный. Это - основание для экспрессии вводимых генов.

 

Больше всего работают на конкретном бакуловирусе, который называется вирусом множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV - multiple nuclear poliedrosis virus). Этот вирус поражает более 30 видов насекомых и лучше чем другие репродуцируется в культуре. В качестве источника клеток - совка люцерны (Spodoptera lagiperda) поражает 80 видов растений. Вирус выделили в 70 году.

 

Векторы для введения генетической информации - стандартная плазмида коли на основе pBR322. Ap res, ori и встроены фрагменты ДНК AcMNPV - последовательность, предшедствующая 5' концу гена полиэдрина и имеющую достаточную для рекомбинации протяженность; промоторная область полиэдрина - Pp; полилинкер; сайт терминации транскрипции и полиаденилирования из этого же гена Pt; дальше кусок ДНК из вируса - второй сайт рекомбинации с ДНК вируса. Все манипуляции в коле, здесь же наработка ДНК для трансфекции.

 

Любое введение ДНК в животные клетки - трансфекция (трансформация - для раковых клеток). Трансфекции подвергают клетки, несущие вирус. Происходит двойной кроссинговер между введенной плазмидой и вирусной ДНК. Исходный ген полиэдрина заменяется на чужеродный. Из-за отсутствия полиэдрина - большинство вирионов инфекциозны, и на газоне клеток - зоны лизиса. Из них выделяют рекомб штамм вируса. (без полиэдрина - лизис, то есть есть вставка, оттуда берут вирус). Зоны лизиса бывают маленькими. Есть улучшенные конструкции, несущие маркерные гены. Наиболее распространенный вариант - lacZ, зоны репродукции вируса окрашиваются в синий цвет. Экспрессия маркерных генов идет с промоторов, которые активны в течение всей репродукции. При использования для экспрессии белка промотора полиэдрина, время наработки белков - 5 суток. На 2000 год экспрессировано и полученов чистом виде более 500 белков. Часть молекул белка, синтезирующихся на поздних стадиях литического цикла не успевают подвергаться пост-трансляционным изменениям. Кроме этого, выяснилось, что линейная ДНК вируса гораздо хуже вызывает инфекционный процесс. Провели улучшение системы бакуловирусных векторов. Наиболее удачным оказался вариант вируса, в который ввели уникальный сайт для рестриктазы Bsu 361. в клетке насеокмых вводили вирусную ДНК после обработки этой рестриктазой. Репродукция происходила лишь в некоторых клетках, где случайно вирусная ДНК закольцовывалась. Но оказалось, что если с линеаризованной ДНК вводить кольцевой вектор, и в нем есть сайты для рекомбинации, то в результате - резко увеличивается количество кольцевых молекул, и значит больше бляшек.

 

Эффективность отбора рекомбинанта при применении такой схемы повысилась с 1 до 30%. Эта система была улучшена за счет введения еще одного сайта для Bsu. В ген, который участвует в репликации. При этом 2 сайта - слева и справа от гена полиэдрина, при рекомбинации ген заменяется на нужный кусок. Но в этом случае пришлось переделать pBR - ввели последовательность ORF16-29 и ORF603. В этом случае выход рекомбинантов 99%. Во всех этих случаях включение чужеродного фрагмента в ДНК бакуловирусов - в клетках насекомых, поэтому бывают сбои. Создали систему для рекомбинации в коле.