Бакмиды

Все рекомб события в коле. Используется конструкция, в которой 5'конец полиэдрина, lacZ, att сайт, который обеспечивает встраивание в lacZ. Ген устойчивости к канамицину, ori для коли и 3' конец гена полиэдрина. В клетках насекомого получили рекомбинантную ДНК, включающей весь геном вируса и эту конструкцию. Так получили бакмиды, если эту ДНК брать из клеток животных, и вводить в колю, то там поддерживается весь геном вируса. Для интеграции в состав бакмиды нужного гена используются вспомогательные плазмиды, которых две. Одна из них несет ген устойчивости к ампицилину и ген, который нужно перебросить в бакмиду. Есть правый фрагмент, обеспечивающий встраивание при транспозиции и левый. Там же ген устойчивости к гентамицину (во встраивомом фрагменте). Стандартно - промотор, полилинкер, терминатор. Вторая плазмида - устойчивость к тетрациклину и ген транспозазы.

 

Если нужно вводить ген, то его вставляют в донорную плазмиду. Такую плазмиду смешивают с ДНК второй вспомогательной плазмиды и трансформируют штамм коли, в котором находится бакмида. После трансформации высевают на среду с канамицином, гентамицином ИПТГ, X-gal. Колонии с нужной вставкой - белые. Проверяют клоны на ампицилин и тетрациклин устойчивость, отбирают чувствительные (не содержащие вспомогательных плазмид). Эти клоны ростят на среде с гентамицином и гентамицином. Идет транспозиция (не рекомбинации).

 

Одна из проблем работы с клетками животных, продуцирующих белки - выделение белка. На насекомых отработаны подходы для улучшения очистки белков. Применили фрагменты ДНК, которые кодируют короткие АК последовательности, необходимые для аффинного связывания при хроматографии на колонках. Один из вариантов - гексагистидин (His6). Последовательность стоит сразу же за промотором и за ней спейсерный участок - пространство. Белок с такой надстройкой при пропускании гомогената клеток через колонку с никель-агарозой задерживается на сорбенте. Затем колонку промывают раствором имидазола, который имея более высокое сродство к никелю, вытесняет белок и после этого полученную фракцию обрабатывают специфической протеазой. Иногда надстройку не удаляют, если белок не используется в мед целях и это не мешает функциональной активности белка.

 

Полседовательность для связывания с глутатионом, тогда он содержится в колонке. Еще одна метка - последовательность из мальтозо-связывающего белка. И поседовательности, узнаваемые моноклональными антителами.

 

В качестве сайтов протеолиза - разные последовательность. Они высокоспецифичны и чтобы небыло для в белке - сайт для тромбина и энтерокиназы.

 

Переходят на клетки насекомых, если другие методы дают низкий выход белка. Получают белки вирусов человека и животных. Антиген вируса синего языка (болезнь коров). Нарабатывают антиген вируса ... Типа 1, белок ВИЧ 1, капсидный белок вируса простого герпеса, гемагглютинин гриппа, белок вируса Ласса, белки полиовирусов, гликопротеин бешенства, гликопротеин 50 псевдобешенества и антиген ротавируса обезьян. Установили, что в дрожжах не могут модифицироваться, и системы модификации - только в клетках животных.

 

Кроме этих экспрессирован один из белков малярийного плазмодия и один из белков сибирской язвы. Сообщается, что можно нарабатывать белок человека, который имеет отношение к наследственным патологиям - регулятор проницаемости мембран (муковисцидоз). Можно нарабатывать аденозиндезаминазу человека. Липаза поджелудочной железы человека. Щелочная фосфотаза - замедленный рост у детей. Нарабатывают альфа и бета интерферноны, интерлейкин 2 и гемопоэтины.

 

Мышиные моноклональные антитела, ДНК-полимеразу человека (альфа) и в последнее время для изучения белков с неизвестной функцией. Ряд рецепторов удалось идентифицировать после экспрессии в клетках насекомых.

 

Лекция 16

 

Помимо работы с клетками насекомых, работают с клетками млекопитающих. Есть белки, которые нормальными в других системах не получаются. Векторы для введения новой генетической информации в клетки млекопитающих разрабатываются по общему принципу: те же векторы из коли, второй же компонент - маркер, обеспечивающий отбор трансфецированных клеток млекопитающих. В качестве маркера - ген неомицинфосфотрансферазы из транспозонов бактерий под промоторами животных. Этот ген оказалось возможным использовать, поскольку генецитин (G-418), к которому клетки чувствительны, а фосфотрансфераза его инактивирует.

 

Следующий маркер - дигидрофолат редуктаза (DHFR), разрушает метотрексат. Этот ген изначально в клетках есть, нужно использовать дефицитные по этому гену клеточные линии. Уровень устойчивости зависит от числа копий гена. И повышая концентрацию метатрексата в среде, можно отобрать клетки с наибольшим количеством копий. Третий маркерный ген - глутаминсинтетаза. Избавляет от аммиака ткани и органы. Всегда есть в клетках млекопитающих, но при попадании в клетки некоторых производных аминокислот активность этого фермента недостаточна для их обезвреживания. Одно из таких веществ метионин-сульфоксимин. Если клетки выращивать на среде с ним, то вырастают только те, у которых - сверхэкспрессия глутаминсинтетазы.

 

Последний фрагмент векторов - участок, обеспечивающий репликацию и стабильное наследование в клетках животных. Все эти фрагменты вирусного происхождения. Используются ретровирусы, вирусы простого герпеса, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы.