Работа над целостным организмом

Все гораздо сложнее, чем у растений. Нужно помнить, что организм высших животных сложнее любого растения. Для его существования - более сложные взаимодействия генов при реализации генет информации. Введение чужеродной генетической информации в животные гораздо менее предсказуемо. Если у растений - хорошие регенеративные свойства, то у животных целостный организм из отдельных тканей невозможно. Если получен вариант животного, несущего чужеродный ген, то размножать его можно только половым способом - потомство получается неоднородным. У растений клон поддерживается без проблем. Невозможно использовать самооплодотворение (как самоопыление у растений), приходится использовать близкородственные скрещивания. Все попытки полностью вырастить млекопитающее из зиготы вне материнского организма не увенчались успехом.

 

Велись работы на мышах. Одним из первых разработан вариант введения генетической информации путем трансфекции бластомеров мыши. Используется восьмиклеточный эмбрион, который обрабатывают вирусными векторами в различных вариантах. Эмбрион подращивается и имплантируется в специально подготовленное животное. Далее потомков анализируют на присутствие гена.

 

Еще один метод - микроинъекции. Получил наибольшее распространение. Для реализации - стимулируют овуляцию (введение сыворотки из крови беременной лошади), через 48 часов - инъекция хорионического гонадотропина человека. Одновременно созревает 30 или больше яйцеклеток. Затем проводят скрещивание с самцами и сразу после скрещивания самки умерщвляются чтобы вымыть яйцелкетки из яйцеводов. Надо сделать до слияния ядер сперматозоида и яйцеклетки. В мужской пронуклеус вводится ДНК. Все это делается при визуальном контроле на специальных микроскопах. С использованием манипуляторов. Дальше происходит слияние пронуклеусов, зигота имплантируется в матку суррогатной матери - специально подготовленная мышь (скрещивание с вазэктомированными самцами - в семенной жидкости нет сперматозоидов). Скрещивание ведет к тому, что начинается подготовка к имплантации. Разрабатывали гормональную стимуляцию, но безуспешно. В матку самки вводят около 30 зигот, в рассчете на то, что хотя бы часть имплантируется нормально. После рождения потомства анализируют каждого на присутствие ДНК. Метод трудоемок, требует специальной подготовки. Квалифицированный специалист - несколько сотен в день. Некоторые из рождающихся погибают сразу после рождения. Их анализируют, но без особого успеха.

 

Берут кусок хвоста, выделяют ДНК и осуществляют ПЦР. Для мышей - из 1000 имплантированных зигот от 10 до 30 трансгенных. Если такой потомок отобран, то его выращивают до половозрелости и проводят имбридинг для закрепления информации. Потомки в каждом этапе инбридинга анализируются. Ведется до получения гомозигот. Тоже есть трудности, связанные с экспрессией генов. Не понятно, почему они перестают работать. В потомстве он вообще не выражается. Тоже не эффективный выход. Чистые линии холят и лелеют.

 

Введение генетически модифицированных стволовых клеток в бластоцисты.

Используется зародыш на стадии начала формирования второго зародышевого листка. Клетки взятые из эмбриона можно поддерживать в культуре и их называют эмбриональными стволовыми. Клетки в этот период плюрипотентны, что собственно и нужно. Их подвергают трансфекции различными методами с использованием различных систем. В основном с использованием вирусов. Всегда стараются отобрать те варианты, в которых встройка в определенный участок генома. Векторные молекулы подбирают так, чтобы интеграция не нарушала процессов развития. Поэтому на какой-то момент небыло понятно, куда же лучше вставлять. Для мышей такие сайты известны, в векторах для трансфекции стволовых клеток маркерный ген и ген, который нужно ввести располагают между последовательностями, гомологичными таким сайтам в хромосомах. В качестве маркеров - ген neoR (устойчивость к гемицитину). Это обязательный компонент, отбор считается одним из самых подходящих на среде с гемицитином. Происходит позитивная селекция. Встройки могут идти и в другие участки и в те, которые важды для эмбриона и потомства. Есть еще 2 гена, позволяющие убрать клетки с ненужными вставками - гены тимидин киназы из HSV (Tk1, Tk2). Если встраивание произошло случайно не по гомологичным последовательностям, то в геноме появляется хотя бы один из генов Tk. Если помещать на среду с ганцикловиром, то под воздействием Tk, он превращается в токсическое соединение. Сразу среда с ганцикловиром и G418 (гемицитин).

 

Если нельзя провести такую селекцию, возможна быстрая проверка клеток с использвованем ПЦР. Для этого - уникальная последовательность в векторе (US). Нигде в геноме ее быть не должно. Использовали разные фрагменты ДНК - либо искусственно синтезируемые, либо бактериальные. Используют конкретные праймеры - один комплементарен этой уникальной последовательности, а второй - тому сайту хромосомы, куда хотели встроить генетическую информацию. Если встройка куда надо, то амплифицируется конкретный по размеру фрагмент.

 

Если клетки идентифицированы, то потом из вводят в бластоцисты мыши. Затем имплантируют в матку суррогатной матери. Получают чисты трансгенные линии с теми же проблемами. Эмбриональные стволовые клетки используют для получения линий с дефектом по конкретному гену - для идентификации функции гена. Стандартный подход для функционального анализа. Известно более 400 линий. Это позволило идентифицировать ряд генов млекопитающих.

 

Knock-out - устойчивость к гемицитину внутрь последовательности гена для нокаута, чтобы слева и справа - участи гена. Кроме того, экзоны, сайты полиаденилирования. Вставляется разорванный ген на место исходного. Отбирают варианты, где гомозиготное состояние этого гена и посмотреть, как это влияет на животное - инактивация генов.

 

На мышах успехи есть. Но иногда нужна экспрессия многих генов, которые нельзя ввести на вирусных векторах. Для некоторых генов необходимо конкретное генетическое окружение - гены продукции иммуноглобулинов. В этом случае вводят YAC. В зиготы - микроинъекция, в эмбриональные стволовые - трансфекция. На этих хромосомах в мышей вводили гены бета-гемоглобина человека. Фрагмент имел длину 250 тпн и содержал 5 функциональных генов для синтеза бета-гемоглобина.

Второй вариант - мыши, способные продуцировать антитела человека. При этом пришлось решать проблему: в мышах есть гены, определяющие продукцию иммуноглобулинов - получили линии у которых нокаутированы свои и введены человеческие. Такие линии содержали кластер генов тяжелых цепей (H-кластер - 4 V, 16 D, 6 J). Вторая вставка - все C гамма и C мю гены. Второй кластер - гены соответствующие легким цепям - 4 V каппа, J, C. Мыши синтезировали человеческие антитела в ответ на введение некоторых антигенов, но разнообразие по специфичности было ограничено. Даже из такой линии были получены гибридомы.

 

Используя этих мышей получали из них эмбирональные стволовые клетки и методом слияния бакт сферопластов с клетками мыши (в сферопластах - YAC). На искусственной хромсоме (размер - миллион пар) 66 VH генов 30 DH генов 6 JH генов и все гены константных участков цепей мю, дельта и гамма. Была соблюдена последовательность как в лимфоцитах человека. Используя эмбриональные стволовые клетки, ввели отдельно другую искусственную хромосому - 800 тпн. Гены легких цепей 35 V, 6J,

 

 

Лекция 18

Получили 2 отдельных линии мышей - одна с тяжелыми цепями, одна с легкими. Далее их скрещивали с линией, где собственные гены иммуноглобулинов нокаутированы и добивались получения чистых линий, не экспрессирующих мышиных иммуноглобулинов. Далее провели аутбридинг чистых линий и были получены мыши, которые в ответ на введение трех сильно различающихся антигенов, на которые вырабатывались чел антитела. Получали мышиные гибридомы.

 

Создание моделей наследственных болезней человека

Есть ряд болезней, где непонятен механизм и участие тех или иных генов: артрит, мышечная дистрофия, ряд нейродегенеративных нарушений (в т.ч. Старческие) и раковые. Когда линии делаются для изучения - одно направление. Другое - продукты каких генов могут компенсировать пат изменения, происходящие при таких болезнях. Цель - получение белков для компенсации дефекта. Именно на мышах начали отрабатывать системы секреции таких белков в молоко. Перспектива - получение в других млекопитающих.

 

Переход от мышей на других животных осуществлялся. Один из объектов - корова. В коровьем молоке - 35 г/л белка. Они самые высокоудойные. Начали работу в начале 90 годов. Использовали ооциты, которые легко получить с мясокомбинатов. Ооциты вымывают из яичников и создают условия для созревания в яйцеклетки. Проводят слияние яйцеклеток со сперматозоидами и тут же подвергают суспензию центрифугированию по особой методике с целью уплотнить желток и сделать видимым муж пронуклеус. Далее микроинъекция (конструкция на вирусных векторах) и создают условия для развития зиготы в эмбрион. Эмбрионы вводят в матку коровы. Все проходит нормально без хирургического вмешательства. На определенной стадии развития эмбрионов отбирают небольшое количество клеток и при помощи ПЦР определяют, есть ли в геноме введенная последовательность. Главное - усовершенствовать весь процесс.

 

• Из молока хотят получать белки для помощи гемофиликам.

• Ведутся разработки по получению безлактозного молока. Вводят лактазу.

• Молоко, обогащенное каппа-казеином - за счет игперэкспрессии коровьего гена. Производство сыра зависит от этого белка.

 

Устойчивость к инфекционным заболеваниям. 20% стоимости продукции - стоимость ветиринарного обслуживания. Пути:

• Введение в геном конкретных генов, соответствующих нужным антителам.

 

Считают, что применимо к крупному, мелкому и свиньям. В отношении мелкого - работают по получению вариантов по получению в молоке белков. Сделано даже больше чем на коровах. Промоторы бета-лактоглобулина, лактоказеина козы - стандартные последовательности, работают в мышах, коровах и овцах. Промотор дает экспрессию в клетках млечной железы. Соединяли с активатором плазминогена, альфа-антитрипсином (очень перспективно), фактором свертываемости VIII, IL-2 (может быть эффективен при лечении рака почек, меланомы), лактоферином, урокиназой.

Полученные овцы и козы не имеют отклонений в лактации и молоком можно вскармливать потомство.

 

Из других вариантов - повышение овец с повышенной скоростью роста шерсти. Ген инсулиноподобного фактора роста I овец под промотором из гена кератина мыши (для экспрессии в эпидермальных клетках).