Получение трансгенных свиней

Есть тканевая близость свиньи и человека. Совпадение по генма МНС. Предполагается, что можно разработать трансгенных свиней с целью использования их органов для пересадки человеку. Здесь главное - подавить гиперострое отторжение сразу после пересадки. Если делать пересадки между видами, то клетки органа начинают разрушаться из-за активации комплемента. Когда это касается свиней, то основным антигеном является углеводный компонент, который часто повторяется в кликокаликсе клеток свиней - углеводный компонент поверхностных клеток свиньи. Нужно вычленить гены, отвветственные за синтез и изменить их так, чтобы не вызывали бурной продукции антител человека. Будут менять структуру гена и структуру углеводного компонента, либо нокаутировать его вообще.

 

Введение генов человека, кодирующе белки, от которых зависит защита чел клеток от своего же комплемента. При этом органы не будут гиперотторгаться. Гены клонированы, экспрессированы в свинье, получен вариант животного, клетки которого не повреждаются комплементом человека в опытах In vitro. Когда пересадили обезъянам - гиперострого отторжения не было. Но отторжение было за счет Т-хелперов.

 

Получение животных продуцирующих чел гемоглобин. Ввели два гена альфа цепи гемоглобина человека, 1 ген бета цепи и регуляторную область гена бета цепи. Экспрессия с промотора свиного гена бета цепей гемоглобина. Для получения компонентов кровезаменителей. Такие свиньи нормальные, получено потомство.

 

Еще одно направление - быстрорастущие свиньи. Бычий гормон роста под промотором металлотионеина млекопитающих. Росли быстрее, но были очень больными - язва желудка, почечная и кишечная недостаточность, заболевание пневмониями. Разбалансированность формирования тканей и органов.

 

Проблема получения идентичных потомков

Клонирование животных. Нужно получить трансген, а дальше можно получать идентичное потомство. Решение проблемы - в установлении клеток, способных сохранять плюрипотентность. В 90 годах - клетки эпителия молочной железы у овец. У коров и коз использовать клетки молочной железы не удалось. Считают, что надо брать клетки эмбрионов.

 

Брали клетки молочной железы овцы - 277 клеток. Из них только 9 дали эмбрионы, родилась одна. Введение ядер - с помощью слияния с применением полиэтиленгликоля, на коровах - микроманипуляторы. После слияния - дробление такой клетки. Должно дойти до опеределенной стадии, и имплантация в матку. Клетки молочной железы в определенной фазе, иначе выход совсем маленький. Почему получилось на овцах и не получилось на других. У овец - особенности дробления. Первые 3 деления - несколько суток. У других - гораздо быстрее. А в период дробления ни один ген не экспрессируется. Считается, что перенесенное ядро при этом осовобождается от репрессоров и связывается с активирующими белками яйцеклетки. Считается, что более детальное изучение формирования ранних стадий может дать прогресс в отношении других млекопитающих.

 

Птицы

Сложность в том, что при оплодотворении в яйцеклетку проникает несколько сперматозоидов, какой сольется - неизвестно. Введение в муж пронуклеус невозможно. Пробовали вводить в цитоплазму, не получилось. Выяснилось, что можно трансфецировать можно зародыши. Подошли ретровирусные вектора млекопитающих. Использовали маркерные гены, полученные цыплята и перепелята наследовали маркерный ген и не продуцировали вирусов. Возникло возражение, что присутствие ретровирусного генома нежелательно. Используют липосомы для введения ДНК на других векторах. Используют бластомеры куриных эмбрионов. Когда начинается развитие эмбриона, его разделяют на клетки и смешивают с суспензией липосом. Добиваются слияния и далее суспензию вводят в подзародышевую область свежеотложенных яиц предварительно облученных радиацией. Облучение необходимо для гибели части клеток исходного зародыша. Трансфецированные бластомеры с большей вероятностью закрепляются в эмбрионе (660 рад/час). Дальше инкубация - птенцы, где в одних клетках есть маркеры, в других нет. Химеры. Дальше химерных цыплят разводят и анализируют пока, не окажется, что маркер - в любой клетке. Это основатель чистой линии.

 

Получение пород кур, устойчивых к инфекциям.

Получение пород с измененным составом желтка и мяса. Не употребляют из-за жира и холестерола. Клонированные гены овальбумина, вычленили промоторы и хотят поменять состав белков, хотят вводить гены человека, чтобы из яичного белка получать мед перпараты.

 

Рыбы

Выделять ДНК научились довно. Вводят электропорацией, трансфекцией, микроинъекции. Можно вводить прямо в цитоплазму. Вводят на вирусных векторах и конкретных генов, ДНК может быть линейной. Либо в цитоплазму яйцеклеток, либо на стадии 4 клеток при дроблении. Дальше оставляют в оптимальных условиях. 70% содержат чужДНК. Хотят модифицировать лосося. Была использована кДНК гена гормона роста лосося под промотором гена антифризного белка североамериканской бельдюги. Лосось - нерка. Такая нерка в возрасте одного года весла в 10 раз больше обычной. Аналогичный эффект - на форели. Хотят перевести на карпа. Для этих рыб проблема болезней и стрессовых воздействий. Большая проблема карпа - гибнут без видимой причины. Причем варьирует от года к году. Будут искать другие гены. Работать на рыбах легче. Главное - найти гены для улучшения их качества при разведений. разы