- •Список сокращений
- •Содержание
- •Часть 1. Понятие о малых дозах радиации ......................................14
- •Часть 2. Радиационно-индуцированная нестабильность генома (ринг) и малые дозы радиации ………...............................75
- •Предисловие
- •От автора
- •Часть 1. Понятие о малых дозах радиации
- •1.1. Большое, малое и низкое
- •1.2. Микродозиметрическая теория «малых доз» радиации
- •1.2.1. Чувствительные мишени (“sensitive volume”) биологических систем
- •1.2.2. Разработка понятия о малых дозах радиации в микродозиметрии. Конкретные величины малых доз для излучений с различной лпэ
- •1.2.3. Целесообразность использования микродозиметрических построений о малых дозах радиации в практике радиобиологии и радиационной медицины
- •1.3. Радиобиологический подход к понятию «малые дозы» радиации
- •1.4. Медицинский (эпидемиологический) подход к понятию «малые дозы» радиации
- •1.5. Новая граница «малых доз» радиации в XXI в. — 100 мГр
- •1.5.1. Комитет по биологическим эффектам ионизирующей радиации ан сша (beir)
- •1.5.2. Министерство энергетики сша (doe — Department of Energy)
- •1.5.3. Документ нкдар о немишенных эффектах ионизирующей радиации от 2006 г.
- •1.5.4. Физический факультет в Гарварде (Harvard Physics Department) и Медицинский радиологический центр в Обнинске
- •1.5.5. Институт безопасности развития атомной энергетики ран (ибраэ ран) и др.
- •1.5.6. Понятие о малых дозах радиации в мкрз
- •1.6. «Малые» и «низкие» дозы в соответствии с конъюнктурой исследований
- •1.7. Понятие малой мощности дозы
- •1.8. Чего придерживаться
- •Часть 2. Радиационно-индуцированная нестабильность генома (ринг) и малые дозы радиации.
- •2.1. Спонтанный мутагенез
- •2.2. Феноменология ринг
- •2.3. Гипотетические механизмы индукции и передачи ринг
- •2.3.1. Инициация ринг: непосредственные повреждения днк или эпигенетические механизмы
- •2.3.2. Индукция ринг активными формами кислорода
- •2.3.3. Ринг и теломеры
- •2.3.4. Дефектность имеющихся теорий о механизмах ринг в свете сути этого феномена
- •2.4. Устоявшиеся обыденно-научные представления о ринг
- •2.4.1. Кармела Мазерсилл с соавторами
- •2.4.2. Дж. Б. Литтл
- •Подпись к рис. 2.4.1
- •2.4.3. Другие авторитетные зарубежные исследователи
- •2.4.4. Авторы из России, Белоруссии и Украины
- •2.5. Почему для ринг при малых дозах радиации складывается конъюнктура в современной радиобиологии и радиационной эпидемиологии
- •2.5.1. Парадоксальность биологического действия ионизирующего излучения
- •2.5.2. Кластерный эффект ионизирующих излучений и малые дозы радиации
- •2.5.3. Ничтожная вероятность индукции канцерогенных мутаций при непосредственном воздействии излучения на гены-мишени в области малых доз
- •2.6. Дозовые закономерности индукции ринг in vitro
- •2.6.1. Факты
- •2.6.2. Те, кто искал дозовый порог для ринг, обычно его и находили
- •2.6.3. Аномалии клеточных систем in vitro
- •2.7. Ринг in vivo
- •2.7.1. Трудность корректной регистрации ринг in vivo. Аберрации хромосом, обнаруживаемые спустя длительные сроки после облучения, не являются однозначным доказательством ринг
- •2.7.2. Экспериментальные подходы для выявления истинной ринг in vivo
- •2.7.3. Ринг in vivo при относительно корректных методических подходах. Возможные артефакты
- •2.8. Ринг после облучения in utero
- •2.9. Кажущиеся «исключения»
- •2.9.1. Линия tk6 лимфобластоидных клеток
- •2.9.3. Клетки HeLa
- •2.9.4. Линия ооцитов китайского хомячка (клетки cho)
- •2.9.5. Мыши линии balb/c
- •2.10. Ринг в документах международных организаций (мкрз, beir и нкдар)
- •Список использованных источников
2.3.2. Индукция ринг активными формами кислорода
Уже более десяти лет имеет место быть теория, согласно которой причина РИНГ связана с постоянно увеличенным внутриклеточным уровнем активных форм кислорода (свободных радикалов). С первого взгляда все кажется логичным и понятным: как было разобрано в подразделе 2.1, спонтанный мутагенез, независимо от конкретных внешних/внутренних причин его индукции, вызывается свободными радикалами кислорода, которые равномерно повреждают молекулу ДНК. РИНГ, по определению, это увеличение частоты спонтанного мутагенеза, и главным типом мутаций при РИНГ являются, как уже отмечалось, точковые [РП6, AL17, AL21, AM36, AM40, AM41, AS19, AT8, AW28]. Вроде бы ясно: в нестабильных клонах должно иметься что-то, какой-то агент, который постоянно вызывает повреждения ДНК, поддерживая повышенный мутагенез или другие неблагоприятные процессы (подавление пролиферации, гибель и пр.; см. выше). На роль подобного агента как раз и подходят свободные радикалы. Уже в 1998 г. в обзоры по РИНГ попал этот также практически канонизированный механизм ее индукции, обусловленный перманентным повышением уровня свободных радикалов у потомков исходно облученной клеточной популяции [AW27]. Эти воззрения остаются в соответствующих публикациях до самого последнего времени, причем формулировка все та же [AW28].
Первичным же источником окислительный ашентов — активных форм кислорода и производных нитроксида (ионов и радикалов нитроксида и пероксинитрита), как полагают, является повреждение мембран митохондрий, в результате чего происходит дисфункцию этих органелл [РМ2, РМ3, РМ12, AD4, AU18].
Между тем, если подходить строго, мы имеем совокупность только косвенных данных, да и то недостаточных для понимания собственно механизма (об этом — ниже). Представим сводку66 тех результатов, что поддерживают свободнорадикальную гипотезу.
1) Для клеток с нестабильностью генома, независимо от причины феномена, характерен повышенный уровень активных форм кислорода:
Нестабильные клетки с атаксией телангиэктазией, имеющие сниженную репарацию ДНК, находятся в состоянии перманентного окислительного стресса [AR3, AW9].
Агенты, индуцирующие окислительный стресс, индуцируют и нестабильность генома. В том числе это относится и к УФ (фибробласты китайского хомячка V79, кератиноциты человека и др.) [AD1, AD4, AD29].
В клетках с РИНГ продемонстрирован увеличенный уровень активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов в опытах in vitro (клетки костного мозга, гибридные клетки CHO, линия GM10115, лимфобласты человека) [AC9, AL11, AL12, AR1, AR17, AR18]. Первая подобная публикация — от 1996 г. [AC9].
В клетках гемопоэтической ткани мышей радиочувствительных линий после облучения in vivo обнаружено наследование как предрасположенности к нестабильности хромосом, так и способности к генерации повышенных количеств окислительных радикалов [AW7].
2) Выращивание облученных кератиноцитов человека линии HaCaT в присутствии антиоксидантов изменяло выраженность проявления РИНГ [AM37].
3) Воздействие ионизирующей радиации на клетки-прародители (линия GM10115) на фоне ингибиторов окислительного стресса (DMSO, глицерина и цистеамина) снижает проявления РИНГ у клонов-потомков [AL14]. Сходные закономерности обнаружены и для отсроченных hprt-мутаций после облучения УФ в присутствии антиоксидантов (наибольший эффект отмечен у восстановленного глутатиона) [AD3].
4) Радиационное воздействие на нормальные эмбриональные клетки человека в условиях гипоксии (2% кислорода) подавляло ряд отсроченных генетических эффектов и гибель клеток-потомков по сравнению с генерациями из контрольных клеток, облучавшихся при 20% кислорода [AR15].
5) Показаны аномалии и дисфункции в митохондриях (основных внутриклеточных продуцентах активных форм кислорода) для генетически нестабильных клеток-гибридов GM10115 при РИНГ [AL11, AK19, AK18].
6) Фермент окислительного стресса гемоксигеназа 1 индуцируется в клонах лимфобластов человека, выведенных из подвергавшихся рентгеновскому облучению клеток, но не из контрольных, необлученных клеток [AR17]. После воздействия радиации на нормальные фибробласты человека перманентное увеличение уровня активных форм кислорода приводило к отсроченной индукции белка TP53 (индуктор апоптоза) [AR18].
7) Передача повреждающего/стимулирующего сигнала от облученных клеток необлученным («эффект свидетеля») через клеточные контакты или через среду инкубации может опосредоваться, в том числе, свободными радикалами или окисью азота [AA12, AA13, AA14, AB16, AL17, AM10, AM11, AM34, AS24, AS25, AS26, AS28, AS29]. Ингибиторы окисляющих соединений и антиоксиданты подавляют указанный эффект: инактиватор окиси азота [AS26], DMSO [AB16], супероксиддисмутаза [AI9, AL22], ингибитор NADP H-оксидазы [AL22], лактат, депренил [AM51] и каталаза [AI9]. Однако прямого отношения перечисленные в данном пункте работы к индукции РИНГ не имеют: в качестве немишенных «эффектов свидетеля» выступали другие, неотсроченные в поколениях параметры повреждения генома. Известна, правда, работа 2005 г. по индукции путем «эффекта свидетеля» нестабильности генома у потомков исходно облученных УФ клеток (по hprt-мутациям) [AD3]. В данном случае антиоксиданты подавляли именно передаваемый через среду от облученных клеток отсроченный в поколениях мутагенез. Но — не от ионизирующей радиации.
Вот основные сведения относительно «индукции РИНГ путем генерации активных форм кислорода», что служит, вкупе с эпигенетической передачей, вторым почти канонизированным механизмом. Сведения, повторим, только косвенные. К тому же и не во всех исследованиях получена поддержка данной теории. Например, на культурах иммортализованных гемопоэтических клеток мышей CBA показано, что после облучения отсроченное подавление пролиферативной активности и другие проявления РИНГ наблюдаются независимо ни от белка p53, ни от продукции активных форм кислорода [AM13].
Тем не менее, как можно видеть, помимо теоретической логики о РИНГ как об активации спонтанных повреждений (а они индуцируются преимущественно свободными радикалами), есть немало и подтверждающих косвенных экспериментальных данных. Но настоящие доказательства все же отсутствуют, если подходить строго. Ведь ясно, что нестабильность генома — это именно нестабильность, которая может обусловливать непредсказуемые дефекты не только в генах репарации ДНК, но и в генах антиоксидантной защиты. Чем первые лучше вторых? Понятно, что нестабильные клоны хуже справляются не только с внешними, но и с внутренними неблагоприятными факторами даже нормального клеточного метаболизма (см. подраздел 2.1). Это реализуется в накоплении свободных радикалов. Вот почему уровень активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов при РИНГ повышен. Но что здесь причина, а что — следствие?
В свою очередь, опосредованное нестабильностью накопление свободных радикалов способно повреждать ДНК и вызывать еще большую нестабильность. Вот почему ингибиторы окислительных процессов снижают проявления РИНГ. Можно сказать: снижают, даже если антиоксиданты вводили в среду при облучении прародительской популяции. Но понятно и это: уменьшается уровень повреждений ДНК в первичной, родительской культуре, и у потомков наследуемые эффекты индуцируются в меньшей степени.
Передача «эффекта свидетеля» через свободные радикалы? И здесь почти то же: экзогенные свободные радикалы даже без посредства посторонних клеток способны много каких повреждений и эффектов (в том числе стимулирующих [РК36, AK25]) индуцировать [AD1, AD4, AD29, AN23]. И если клетку облучили, то из-за повышенного эндогенного уровня таких радикалов они вполне могут выходить в культуральную среду (или передаваться через клеточные контакты).
Вот и все. На наш взгляд, следует отдавать себе отчет в том, что и механизм индукции РИНГ через свободные радикалы — все еще только гипотеза, несмотря на более чем 10-ти-летнее исследование. И эта гипотеза нисколько не лучше индукции РИНГ через некие неизвестные повреждения ДНК в облученных клетках-прародителях.