Окончание табл. 4

	V. ch	olerae					^..
			V.alben-	V. рага-	V. algino-	V. costl-	V. angul-
Признаки		02, 03	sis	haerno-lyticus	llticus	cola	larum
	01	и т. д.
Рост в 1% пептонной воде, содержащей NaCI, %:
0	+	+	+	—	—		+
8				+	+	+	-(+)
10	———				+	+
Фосфоресценция			+
Роение на 1,5% агаре					+

Условные обозначения: + — положительный результат; — — отрицательный результат; +— — возможны оба варианта; (+) или (—) — встречается редко.

На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические и культурные признаки, относящиеся по 6'иохимической активности к I группе по Хейбергу, агглютинирующиеся групповой (01) и вариантоспеци-фической холерными сыворотками (Огава, Инаба) не менее чем до 1/2 титра и лизирующиеся холерными ди­агностическими бактериофагам'и в рабочем разведении, можно давать заключение о принадлежности их к V. cholerae 01 сразу же, определяя для них принадлеж­ность к биовару (табл. 5).

Та блица 5

Дифференциальные признаки биоваров vibrio cholerae 01

	Био	вары
Признаки	cholerae	eitor
Лизабельность фагами: холерным «С» Эль-Тор Агглютинация эритроцитов Чувствительность к 30 ЕД полимиксина Гемолиз эритроцитов барана	++	++ + —

Для культур с такими отклонениями от типичных свойств, как агглютинация диагностическими сыворот­ками 01 и Инаба (Огава) ниже 1/2 титра, полная или частичная резистентность 'к диагностическим бактерио­фагам и др., обязательным является изучение призна­ков, определяющих их принадлежность к виду V. chole­rae рода Vibrio (табл. 3). Определение указанных при-' знаков обязательно также для культур, агглютинирую­щихся только RO сывороткой.

Для слабоагглютинирующихся 01 сывороткой и фа-горезистентных культур является обязательным также подтверждение специфичности взаимодействия культуры с холерной 01 сывороткой. С этой целью используют один из дополнительных методов серологической иден­тификации: люминесцентно-серологический, РПГА, ре­акцию иммобилизации или адсорбции агглютининов по Кастеллани.

¹ Таблицаб

Биохимическая классификация вибрионов по Хейбергу, Смиту и Гуднеру

	ф	ерментация углерод	10В
Группа	манчозы	сахарозы	арабинозы
I	+	+	—
II		+
III	+	+	+
IV		+	+
; V	+	~~~
VI		———
VII	+	———	+
S- VIII

Вибрионы, агглютинирующиеся холерными диагно­стическими сыворотками 01 и вариантоспецифической по 1/4 титра, лизирующиеся в диагностическом титре хо­лерным бактериофагом, следует относить к холерным 01 группам.

Культуры вибрионов с другими вариантами положи­тельного взаимодействия с холерными диагностическими сыворотками и бактериофагами, а также агглютиниру­ющиеся только RO сыворотками, требуют дополнитель­ного исследования 'в лаборатории противочумного уч­реждения.

Характеристика культур холерных вибрионов 01 пре­дусматривает также оценку вирулентных свойств в це­лях определения их принадлежности к группе вирулент­ных или слабовирулентных-авирулентных для решения вопроса об объеме профилактических и противоэпиде­мических мероприятий.

У всех культур холерных вибрионов серогруппы 01 изучают вирулентность по фаговому тесту, и гемолитиче-ской активности.

Изучение вирулентности на лабораторных животных обязательно для следующих культур холерных вибрио­нов, выделенных от больных людей:

— гемолизположительных в пробе Грейга, типичных По признаку взаимодействия о холерными агглютини­рующими сыворотками и диагностическими бактериофа­гами;

— гемолизотрицательных, авирулентных или слабо­вирулентных по фаговому тесту;

— гемолизотрицательных, атипичных по признаку взаимодействия с холерными диагностическими сыво­ротками или бактериофагами.

Изучение вирулентности на лабораторных животных Обязательно для следующих .культур, выделенных из объектов окружающей среды и здоровых людей:

— гемолизположительных, лизирующихся в рабочем разведении ХДФ, типичных по взаимодействию с холер­ными диагностическими сыворотками и бактериофагами;

— гемолизотрицательных, типичных по признаку взаимодействия с холерными диагностическими сыворот­ками и бактериофагом при отсутствии случаев заболе­вания холерой;

— вирулентных по фаговому тесту и гемолизу при отсутствии случаев заболевания холерой.

Окончательную оценку вирулентности таких вариан­тов культур дают по результатам исследования на жи­вотных.

Считать вирулентными без изучения на лаборатор­ных животных культуры холерных вибрионов 01, типич­ные по всем основным признакам, вирулентные по фаго­вому тесту и гемолизу, выделенные от больных с кли­никой холеры во всех случаях, а также от здоровых лиц и из объектов окружающей среды при наличии слу­чаев заболевания холерой.

Считать слабовирулентными-авирулентными без изу­чения на лабораторных животных следующие варианты культур холерных вибрионов 01:

— выделенные от больных атипичные по признаку взаимодействия с холерной диагностической сывороткой или бактериофагом, авирулентные или слабовирулент-•ные по фаговому тесту и гемолизу;

— выделенные из окружающей среды и от здоровых лиц гемолизотрицательные, атипичные по признаку вза­имодействия с диагностическими сыворотками или бак­териофагами, слабовирулентные или авирулентные по фаговому тесту;

— выделенные из окружающей среды и здоровых лиц слабовирулентные или авирулентные по фаговому тесту и гемолизу, за исключением варианта с типичны­ми свойствами и чувствительностью к фагам ХДФ, иден­тичной вирулентным.

Для полной характеристики выделенных культур холерных вибрионов 01 изучают Также фаготип и Чувст­вительность к антибиотикам, используемым для лече­ния.

Идентификацию культур, подозрительных на вибри­оны, неагглютинирующихся на стекле холерными диаг­ностическими сыворотками, проводят по тестам, опре­деляющим их принадлежность к виду V. cholerae (табл. 3,4,6).

Все культуры V. cholerae, выделенные от людей, изу­чают в развернутой реакции агглютинации с холерными диагностическими сыворотками и определяют у них чувствительность к монофагам «С» и Эль-Тор.

Культуры вибрионов вида V. cholerae, неагглютини­рующиеся холерными сыворотками 01 и RO и варианто-специфическими (Огава, Инаба), лизирующиеся и не-лизирующиеся диагностическими бактериофагами, от­носят к холерным вибрионам «не 01» группы (НАГ-виб-

рионам).

Культуры НАГ-вибрионов, чувствительные к холер­ным диагностическим фагам, требуют тщательной серо­логической идентификации с использованием дополни­тельных методов (агглютинация с прогретым антиге­ном, люминесцентно-серологический, реакция иммоби­лизации, пассаж на средах).

Ускоренная идентификация культур по основным признакам

Отдельную колонию или чистую культуру отсевают на питательный бульон или 1 % пептонную воду в объе­ме 5 мл и после 3 ч инкубации изучают следующие при­знаки:

— агглютинабильность холерными диагностическими сыворотками в 1% пептонной воде;

— чувствительность к холерным диагностическим бактериофагам «С» и Эль-Тор;

— принадлежность к биохимической группе Хейбер-га с использованием среды в объеме 1 мл и учетом результатов через 3—6 ч.

Экспрессная серологическая идентификация холер­ных вибрионов 01 проводится методами:

— люминесцентно-серологическим (п. 4);

— реакцией иммобилизации и микроагглютинации ^с помощью фазовоконтрастного устройства (п. 6);

— реакцией пассивной гем агглютинации (РПГА) с

использованием холерного иммуноглобулинового эри-троцитарного диагностикума в соответствии с наставле­нием к этому препарату.

4. МЕТОДЫ УСКОРЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ

Методы ускоренной диагностики используются наря­ду с классическим методом при поступлении материала от больных с подозрением на холеру и трупов лиц, умерших от острых кишечных заболеваний.

Люминесцентно-серологический метод

Порядок приготовления мазков, обработки их люми-

'несцирующей сывороткой, микроскопии и оценки резуль­татов описаны в Наставлении по применению сыворотки диагностической холерной люминесцирующей. Чувстви­тельность метода — 10⁶ микробных тел (м. т.) возбуди­телей холеры в 1 мл материала.

Метод используют для непосредственного исследова­ния нативного материала и пептонной воды (рН 7,6 — 7,8), засеянной исследуемым материалом и инкубиро­ванной при температуре 37° С в течение 3—6 ч. Нараста­ние количества специфически «окрашенных» вибрионов в мазке свидетельствует о наличии возбудителя холеры в исследуемом материале. Положительный результат может быть получен и через 1,5—2 ч с начала исследо­вания при содержании холерных вибрионов в 1 мл 1 млн м. т. и более. При небольшом содержании вибрионов их можно обнаружить после подращивания материала на жидких и плотных питательных средах. Для этого исследования берут испражнения или рвотные массы по 0,1 мл, засевают одновременно на 1% пептонную во­ду и 4 чашки с агаром рН 7,8—8,0. Посевы выращива­ют пр'и температуре 37° С в течение 3, 4, 5, 6 ч. Затем на одну чашку через 3 ч инкубации наносят 0,2—0,3 мл 0,85% раствора хлорида натрия или 1% пептонной во­ды и с помощью шпателя делают смыв бактерий. Смыв с чашки и поверхностную пленку бактерий с 1 % полтон­ной воды используют для приготовления' мазков и по­следующей обработки люминесцирующей сывороткой. Если через 3 ч подращивания холерные вибрионы не

•обнаружены, то исследование повторяют через 4, 5, 6 ч подращивания. При просмотре мазков, обработанных холерной люминесцирующей сывороткой, особое внима­ние следует обращать на форму светящихся микробов, так как в отдельных случаях специфически «окрашен­ные» микробы, обнаруживающиеся в мазках из испраж­нений здоровых людей, резко отличаются от вибрионов по морфологии (грубые, крупные палочки, кокки, дипло-'

кокки).

Ответ по результатам исследования люминесцентно-серологическим методом выдается как предварительный.

Метод иммобилизации вибрионов специфической холерной 0-сывороткой

Чувствительность метода — не менее 4,3 • 10⁵ бакте­рий в 1 мл. На предметное стекло наносят пипеткой или петлей 2 капли испражнений, смывы с ректального там­пона, верхнего слоя среды накопления. Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), к второй до­бавляют каплю 0-сыворотки в разведении 1:100, пере­мешивают и накрывают покровным стеклом. Раздав­ленную, каплю смотрят под микроскопом при увеличе­нии 400—600 ^х, используя фазово-контрастное устрой­ство или конденсор темного поля. При наличии в иссле­дуемом образце холерных вибрионов в первой капле наблюдают характерную подвижность; во второй капле подвижность вибрионов прекращается немедленно или в течение 1—2 мин. Для определения принадлежности вибрионов к серовару можно пользоваться сыворотками Инаба и Огава в разведении 1 : 50.

Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15—20 мин с нача­ла исследования. При отрицательном результате иссле­дование повторяют после 4—6 ч подращивания на 1% пептонной воде. Для определения титра иммобилизации Можно использовать разведения сывороток до их титра.

Ответ по результатам исследования методом иммо­билизации вибрионов специфической холерной 0-сыво­роткой дают как предварительный.

Исследование материала реакцией агглютинации в пептонной воде и в пробе с диагностическими бактериофагами

Чувствительность метода — 10⁵ микробных тел в 1 мл. Метод может быть использован для непосредст­венного исследования материала от больных и после

подращивания его на пептонной воде в течение 3—6 ч. Исследование без подращивания дает возможность в большинстве случаев клинически выраженных заболе­ваний поставить окончательный диагноз через 2—3 ч после поступления материала. ' Порядок исследования:

1. На предметное стекло наносят 2 капли исследуе­мого материала, накрывают покровным стеклом и про­сматривают препараты под микроскопом с фазово-кон-трастным устройством или темнопольным конденсором, обращая внимание на морфологию и подвижность мик­робных клеток. Одновременно можно поставить реакцию иммобилизации с холерной 0-сывороткой. Обнаружение в раздавленной капле даже единичных вибрионов при большом количестве посторонней микрофлоры может служить показанием к исследованию данным методом.

2. Ставят пробу с диагностическими холерными бак­териофагами «С» и Эль-Тор двуслойным методом по ме­тодике, указанной в п. 5, внося в охлажденный полу­жидкий 0,7% агар вместо культуры вибрионов 0,5 мл жидких испражнений больного.

3. Агглютинирующиеся холерные сыворотки О, Ога-ва, Инаба разводят в пределах титра 1% пептонной во­дой в объеме 1 мл. Во все пробирки добавляют по 2— 3 капли исследуемого материала. Обязательно ставят контроль сыворотки и антигена.

Учет реакции агглютинации начинают проводить че­рез 1 ч, а фаголизиса—через 1,5—2ч инкубации при температуре 37° С. При отрицательных результатах на­блюдение ведут в течение 3 ч с момента постановки опыта.

При положительном результате реакции агглютина­ции отмечают агглютинативный рост с просветлением среды или мелкозернистую агглютинацию при отсутст­вии ее в контрольной пробирке. При отрицательном ре­зультате отмечают рост в виде диффузного помутнения.

При положительной реакции в пробе с фагом наблю­дают четко выраженные пятна лизиса. Отчетливое по­мутнение агаровой среды при отсутствии феномена ли­зиса можно считать отрицательным результатом иссле­дования на чувствительность к фагу.

Учитывая возможность интенсивного размножения посторонней микрофлоры, результаты исследования можно считать достоверными лишь при своевременном их учете.

При отрицательном результате исследование можно повторить тем же методом, используя посев на 1 % пеп-тонную воду (3—6-часовое подращивание).

В случае положительного результата исследования в реакции агглютинации с сывороткой 01,-вариантоспеци-фической, а также в реакции фаголизиса в сочетании с данными микроскопии можно давать окончательный от­вет, продолжая исследование в целях выделения куль­туры и ее изучения.

При положительной реакции агглютинации и отри­цательной пробе с диагностическими бактериофагами результат считать предварительным.

При исследованиях в очагах целесообразно иметь заранее раститрованные сыворотки и бактериофаги, ко­торые могут сохраняться в течение дня. Это позволяет сократить время выполнения срочного анализа.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием холерного иммуноглобулинового эритроцитарного диагностикума

Порядок подготовки материала, ингредиентов, поста­новки и учета реакции изложен в Наставлении по при­менению диагностикума холерного эритроцитарного ан­тительного, прилагаемого к препарату.

5, МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СВОЙСТВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

Серологический идентификация

Ориентировочную реакцию агглютинации ставят в чашке Петри с обезжиренным стеклом с О, RO и вари-антоспецифическими сыворотками Огава и Инаба в раз-ведениях 1:50—1:100, используя 16—20-часовую ага-ровую культуру.

Развернутую реакцию агглютинации в 0,9% ..раство-ре^хлорида натрия ставят и учитывают по общеприня­той методике в соответствии с наставлением к диагно­стической сыворотке. При необходимости постановки реакции агглютинации с гретыми культурами их про­гревают при температуре 100° С в течение 2 ч и дважды Отмывают 0,9% раствором хлорида натрия.

Развернутая реакция агглютинации в жидкой пита­тельной среде используется для ускоренной серологиче

ской идентификации. Колонию или чистую культуру бак­терий отсевают в питательный бульон в объеме 3 мл и инкубируют 3 ч при температуре 37° С. Агглютинирую­щую холерную ,0-сыворотку разводят в пределах титра стерильной 1% пептонной водой. Затем в каждую про­бирку, содержащую 1 мл среды и определенное количе­ство сыворотки, добавляют 1—2 капли изучаемой буль­онной культуры. Контролем служит 1 мл среды без сы­воротки. Все пробирки помещают в термостат при тем­пературе 37° С и через 1—3 ч учитывают результаты (в зависимости от интенсивности роста культуры). При по­ложительной реакции в опытных пробирках наблюда­ется агглютинация в виде мелких, компактных хлопь­ев; в контроле — равномерное помутнение среды. Из контрольной пробирки для изучения морфологии кле­ток готовят мазки и висячую каплю.

Экспрессная серологическая идентификация холерных вибрионов с помощью фазово-контрастного устройства методом микроагглютинации и иммобилизации. Готовят ряд двукратных разведении холерных агглютинирую­щих сывороток (О, Огава, Инаба) в 1% пептонной во­де (рН 7,4) или 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,2—7,4), начиная с разведения 1:50 до титра. Агаро­вую 10—18-часовую культуру вибрионов суспендируют в 1% пептонной воде или в 0,9% растворе хлорида нат­рия до концентрации взвеси 3—4 млрд м. т. в 1 мл по оптическому стандарту мутности. На обезжиренные предметные стекла большой бактериологической петлей (диаметр петли 5—7 мм) наносят ряд разведении сы­воротки (опыт). Каплю суспензии вибрионов, взятой той же петлей, смешивают на предметном стекле с пер­вой каплей, накрывают чистым обезжиренным покров-/ным стеклом и рассматривают в фазово-контрастном устройстве с объективом 40^х в течение от 'нескольких секунд до 5 мин. В контрольном препарате (капля пеп­тонной воды или 0,9% раствора хлорида натрия+1 кап­ля взвеси культуры) видна характерная подвижность значительной части вибрионов. В опытных препаратах с положительным результатом исследования наблюда­ются явления агглютинации (склеивания) и иммобили­зации вибрионов. Степень агглютинации оценивают по четырехбалльной системе аналогично оценке разверну­той агглютинации в пробирках. Иммобилизация вибрио­нов проявляется в виде полного прекращения движения всех .или почти всех вибрионов. Оценку интенсивности реакции производят следующим образом: ++++—к началу просмотра препарата почти все вибрионы скле­ены в компактные, неподвижные конгломераты (в от­дельных случаях не наблюдается образование конгло­мератов, но отмечается иммобилизация основной массы вибрионов, поэтому в этих случаях следует ставить ре­акцию агглютинации в пробирках); +++—аналогич­ные конгломераты образуются с некоторой задержкой /2—4 мин); ++—образование рыхлых и меньших по размеру неподвижных конгломератов на протяжении 4—5 мин после контакта взвеси культуры с сывороткой;

в поле зрения много изолированных, преимущественно подвижных вибрионов: +—иммобилизация части виб­рионов в течение 4—5 мин без образования конгломе­ратов. Учету как «положительная реакция агглютина­ции» в данном разведении подлежат лишь случаи, оце­ниваемые не ниже чем на ++. При этом следует иметь в виду, что разведению сыворотки в пробирках соответ­ствует удвоенное окончательное разведение сыворотки на стекле (петля сыворотки + петля взвеси).

Люминесцентно-серологический метод и реакция пассивной гемагглютинации с диагностикумом холерным эритроцитарным иммуноглобулиновым применяются в соответствии с наставлениями к препаратам.

Определение индофенолоксидазы

Учитывая различную 'способность вибрионов к обра-, зованию оксидазы в зависимости от состава питательных сред необходимо предварительно испытать используе­мые питательные среды с контрольной культурой. Ок-сидазу можно выявлять различными методиками:

а) на поверхность 18-часовой агаровой культуры на­носят каплю 1% водного раствора парааминодиметил-анилина (гидрохлорида или оксалата), добавляют кап­лю 1% спиртового раствора альфа-нафтола. Положи­тельная реакция на индофенолоксидазу — ярко-синяя окраска через 1—3 мин;

б) на поверхность 18-часовой агаровой культуры на­носят несколько капель 1% водного раствора тетраме-тилпарафенилендиамина (гидрохлорида) или диметил-ларафенилендиамина (дигидрохлорида) и быстро на­клоняют чашку на бок. При положительной реакции че-Рез 20—30 с колонии вибрионов в направлении от пери­ферии к центру стойко окрашиваются в темно-красный

цвет. По этой же методике может быть использован 1 % водный раствор этилоксипарафенилендиамина сер­нокислого (входит в набор для обработки бумаги «фо­тоцвет») ;

в) агаровую культуру бактерий, взятую платиновой петлей или изогнутым концом пастеровской пипетки (петли из другого металла применять недопустимо), вносят в каплю 1 % водного раствора диметилпарафе-нилендиамина (дигидрохлорида) на стекле чашки Петри и перемешивают. При положительном результате взвесь бактерий через 20—30 с окрашивается в красный цвет.

Определение типа расщепления глюкозы (OF-тест, тест Хью-Лейфсона)

В две пробирки со средой Хью-Лейфсона засевают уколом в столбик изучаемую культуру. Поверхность среды в одной из пробирок покрывают 0,5—1 мл сте­рильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при температуре 37° С 3—4 сут. Ферментацию глюкозы оп­ределяют по изменению цвета среды в анаэробных и аэ­робных условиях роста. При окислении глюкозы цвег среды изменяется только в аэробных условиях роста.

Определение декарбоксилаз и дегидролаз аминокислот

В пробирки с пептонно-дрожжевой средой (конт­роль) и этой же средой, содержащей дополнительно раздельно 1% L-лизина, 1% L-орнитина, 1% L-аргини-на, вносят по полной петле 18-часовой культуры бакте­рий и заливают 0,5—1 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при температуре 37° С. Учет результатов производят ежедневно до 4 сут. При фер­ментации аминокислот происходит защелачивание сре­ды и исходный травянисто-зеленый цвет среды изменя­ется в синий цвет.

Определение ферментации углеводов и многоатомных спиртов

Изучаемую культуру засевают в жидкие или полу­жидкие среды с углеводами или спиртами (глюкозой, лактозой, сахарозой, арабинозой, маннозой, маннитом. инозитом) и индикатором бромтимоловым синим (или Андреде, ВР). Посевы инкубируют при температуре 37° С и учитывают результаты через 6—18 ч. Фермен­тацию маннозы для неагглютинирующихся 01 сыворот­кой вибрионов целесообразно изучать на забуференной полужидкой среде (приложение 10, п. 1).

Определение диастатической активности

Культуру засевают в среду с крахмалом и индика­тором Андреде, инкубируют 12—18 ч при температуре 37° С. При расщеплении крахмала среда краснеет.

Определение протеолитических свойств

В столбик среды с желатиной уколом засевают 18-часовую агаровую культуру и инкубируют в течение 2—3 сут при температуре 20—23 или 37° С в течение 18 ч. Перед учетом результатов пробирки помещают в холодильник на 20 мин. При положительном результате желатина остается жидкой, а при отрицательном (в кон­трольной пробирке) — затвердевает.

Определение образования индола

Культуру засевают в пробирку с 1 % пептонной во­дой, инкубируют при температуре 37° С в течение 6— 18 ч. Затем вносят в среду с культурой 0,5 мл реактива Ковача, встряхивают. При наличии индола верхний слой среды в пробирке приобретает интенсивную красную окраску.

Определение уреазной активности

Испытуемую культуру высевают петлей на среду с мочевиной (Кристенсена) и инкубируют при температу­ре 37° С в течение 18—20 ч. Расщепление мочевины оп­ределяют по изменению окраски в красно-фиолетовый Цвет.

Постановка реакции Фогеса-Проскауэра на ацетилметилкарбинол

Испытуемую культуру засевают в глюкозо-фосфатный бульон Кларка и инкубируют при температуре ⁰⁷ С в течение 1—3 сут. Затем к 1 мл среды с культу -

рой добавляют 0,6 мл 6% спиртового раствора альфа-нафтола и 0,4 мл 40% раствора гидроксида калия. Про­бирку встряхивают и помещают в термостат на 1ч. При положительной реакции среда окрашивается в розовый или ярко-красный цвет.

Определение чувствительности к диагностическим фагам

В лабораторной диагностике при определении био­вара холерных вибрионов используют холерные бакте­риофаги «С» и Эль-Тор. При оценке результатов проб с фагами необходимо ориентироваться на диагностиче­ский рабочий титр (ДРТ), который обычно обозначают на этикетках. Определение чувствительности к фагам проводят как с цельными препаратами, так и с их 10-кратными разведениями до ДРТ в мясопептонном буль­оне. Для постановки реакции в чашки разливают ire-лочной агар. После застывания агара и подсушивания его в течение 30 мин при температуре 37° С дно чашек делят на квадраты по количеству образцов и 10-крат­ных разведении фага. В пробирку с 5 мл 0,5—0-7% пи­тательного агара, расплавленного и охлажденного до 45°, добавляют 0,1—0,2 мл 3—4-часовой бульонной куль­туры, тщательно смешивают и выливают на поверх­ность агара. Чашки оставляют при комнатной темпера­туре с открытыми крышками на 30 мин. В центр квад­ратов наносят штампом-репликатором, стандартной пет­лей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой по кап­ле фагов в соответствующих разведениях. После подсы-хания капель чашки переворачивают вверх дном и по­мещают в термостат при температуре 37° С. Результа­ты учитывают через 2—4 и 18—20 ч. Наличие лизиса в виде одного «стерильного» пятна или группы мелких негативных колоний оценивается как положительный результат.

Определение чувствительности к полимиксину

В расплавленный и остуженный до 45—50° питатель­ный агар (рН 7,0—7,2) добавляют полимиксин М или В из расчета 30 ЕД на 1 мл среды. После перемешива­ния среду разливают в чашки Петри. На застывшую среду наносят бактериологической петлей штрихом 3— 18-часовую бульонную культуру. Результаты учитывают после инкубации посевов при температуре 37° С в тече­ние 18 ч. Холерные вибрионы биовара cholerae не рас­тут на полимиксиновом агаре, биовара eitor — растут.

Постановка реакции гемагглютинации

На стекле в чашке Петри помещают каплю 0,9% раствора хлорида натрия и суспендируют в ней петлей 18-часовую агаровую культуру. Затем добавляют кап­лю 2,5% взвеси куриных, бараньих или морской свинки:

эритроцитов, трижды отмытых физиологическим раст­вором. Стекло покачивают до смешивания эритроцитов и вибрионов. При положительной реакции в течение

1 мин наступает склеивание эритроцитов. Реакцию со­провождают двумя контролями: а) в каплю 0,9% раст­вора хлорида натоия добавляют каплю' 2,5% взвеси эритроцитов; б) в'капле 0,9% раствора хлорида натрия суспендируют испытуемую культуру — контроли дол­жны быть отрицательными.

Определение гемолитической активности

К 1 мл суточной культуры, выращенной в 4—5 мл мясопептояного бульона, добавляют 1 мл 1 % взвеси трижды отмытых эритроцитов барана в 0,9% раствора хлорида натрия. Смесь микробов и эритроцитов осто­рожно перемешивают встряхиванием и помещают на

2 ч в термостат при температуре 37° С, а затем в холо­дильник до следующего дня. Предварительный учет ре­зультатов проводят через 2 ч, окончательный — на сле­дующий день. При положительной реакции наступает полный или частичный лизис эритроцитов (лаковая кровь). В контроле (бульон — 1 мл и 1 мл взвеси эрит­роцитов) гемолиз отсутствует.

Постановка теста «тяжа»

На стекло чашки Петри наносят каплю 0,4% водно-fo раствора дезоксихолата натрия или 2,5% водного Раствора моющего средства «Прогресс» и в ней сус­пендируют петлей 18-часовую агаровую культуру ис­следуемого штамма. При положительной реакции через ¹—2 мин образуется вязкая масса, которая тянется за утлей, при отрицательной — «нитей» не образуется. Холерные вибрионы и другие грамотрицательные бактерии дают положительный результат.

Определение способности фосфоресцировать

Изучаемые штаммы засевают в 1% пептонную воду или на пластинки щелочного агара, инкубируют при температуре 37° С в течение 18 ч. Выросшие культуры просматривают в темной комнате. Свечение наблюдают после 5—10-минутной адаптации в темноте.

Определение свойств вибрионов с помощью системы индикаторной бумажной (СИБ)

Система индикаторная бумажная для идентифика­ции вибрионов (СИБ) позволяет определять индофено-локсидазу, уреазу, образование индола, декарбоксила-зы лизина и орнитина, дегидролазу аргинина, фермен­тацию глюкозы, лактозы, сахарозы, маннозы, арабино-зы, маннита. Систему используют в соответствии с ин­струкцией по ее применению, прилагаемой к препа­рату.

Определение чувствительности холерных вибрионов к антибиотикам

Чувствительность вибрионов к антибиотикам опреде­ляют методом диффузии в агар с использованием бу­мажных дисков с антибиотиками или методом серий­ных разведении в плотной или жидкой питательной сре­де, руководствуясь методикой исследований (приложе­ние 10, пп. 5, 6).

Определение 'вирулентности холерных вибрионов

Определение вирулентности холерных вибрионов биовара Эль-Тор по фаговому тесту и гемолитической активности. Исследование проводят в соответствии с на­ставлением, прилагаемым к препарату. У исследуемой культуры холерного вибриона биовара Эль-Тор опреде­ляют чувствительность к трем монофагам — ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5. Культуру выращивают 3—4 ч в пептон-ной воде или бульоне Мартена (рН 7,6) и петлей засе­вают на агаровые пластинки. Через 18—20 ч инкубации при температуре 37° С отсевают типичные колонии в про­бирку с 4—5 мл бульона Мартена и инкубируют 3—4 ч при температуре 37° С. Если культура сильно диссоции-рована, типичные колонии отбирают путем селекции.

Для постановки реакции с фагами используют щелоч-дой агар 1,5—2% (рН 7,2—7,4, но не выше), приготов­ленный на любой основе. Агар расплавляют на водя-цой бане, заливают в чашки Петри по 20-—25 мл. После застывания подсушивают около 30 мин при температуре 37° С. Дно чашки размечают на 12 квадратов (3 ряда по 4 клетки) по одному ряду клеток на разведение каждо­го монофага: 10-', Ю-², Ю-³, Ю-⁴. В пробирку с 4 мл О 7% агара Хоттингера, расплавленного на водяной баяе и остуженного до 45°, добавляют 0,2—0,3 мл 3—4-часовой бульонной культуры испытуемого штамма виб­рионов, тщательно смешивают и выливают на агаровую пластинку в чашки Петри. После застывания слоя ага­ра с культурой чашки подсушивают при комнатной тем­пературе с полуоткрытыми крышками. Фаги наносят на газон культуры платиновой петлей диаметром 2 мм или репликатором. Чашки с нанесенными фагами после подсыхания его капель закрывают крышками, перевора­чивают вверх дном и инкубируют при температуре 37° С в течение 16—18 ч. В экстренных случаях результат можно учитывать через 3—4 ч. Оценку литического дей­ствия фагов производят по 4-балльной системе:

+ + + + — полный лизис, + + + — множественные нега­тивные колонии или полный лизис со следами вторич­ного роста, + + — изолированные негативные колонии (не менее 10) или пятно лизиса со значительным вто­ричным ростом. Вирулентность культур определяют по совокупности признаков, указанных в табл. 7. Штаммы холерных вибрионов биовара Эль-Тор по фаголизису и гемолитической активности делятся на три группы: ви-Рулентные, слабовирулентные и авирулентные.

Определение вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков. Наиболее чувствительной ^делью экспериментальной холерной инфекции явля­йся кролики-сосунки, зараженные внутримышечно. Ис­пользование этой модели для определения вирулентно-^и холерных вибрионов требует строгой унификации ^ех этапов исследования и единого подхода к оценке получаемых результатов. По степени вирулентности Холер.ные вибрионы подразделяются на вирулентные, ^абовирулентные и авирулентные. Методика постанов-^ки и оценка результатов даны в специальных методиче­ских рекомендациях (приложение 10, п. 1).

Определение вирулентности холерных вибрионов на ""Дели мышей-сосунков.

Таблица 7i

Схема дифференциации вирулентных, слабовирулентных и авирулентных холерных вибрионов биовара Эль-Тор по фаговому тесту и гемолитической активности

Серовар холерного		Чувс к	твитель монофаг	ность ам	Гемолиз i бараньих i
вибриона Эль-Тор	Вирулентность	ХДФ-3	ХДФ-4	ХДФ-5	эритро­цитов
Огава и Гико-	Вирулентные	+	+	-1-
шима		+	+	—	—
		—	+	+	—
		+	—	+	—
	Слабовирулент­	+	+	+	4-
	ные	+	+	—	+
		—	+	+	+
		+	—	+	+
		—	—	+	+ (-)
	Авирулентные	—	—	—	+ (-)
		+	—	—	+ (-)
		—	+	—	+ (-)
Инаба	Вирулентные	• +	+	+	—
		+	+	—	—
		—	+	+	—
		+	—	+	—
		—	—	+	—
		+	—	—	—
	Слабовирулент­	+	+	+	+
	ные	+	+	—	+
		—	+	+	+
		+	—	+	+
		—	—	+	+
		+	—	—	+
	Авирулентные	—	—	—	+ (-)
		—	+	•—	+ (-)

Условные обозначения: + — положительный результат; — —" отрицательный результат; (—) — отрицательный, встречается редко.

Использование в опыте перорального заражения мы-шей-сосунков массой 2—5 г требует особой тщательно­сти выполнения методических приемов и умения разли­чать случаи гибели животных от неспецифических фак­торов (травма и др.). По результатам исследования штаммы холерных вибрионов оценивают как вирулент­ные, слабовирулентные и авирулентные. Методика ис­следования и оценка результатов изложены в специаль­ных'рекомендациях (приложение 10, п. 1).

6. ПОРЯДОК УЧЕТА АНАЛИЗОВ, ОФОРМЛЕНИЯ И ВЫДАЧИ РЕЗУЛЬТАТОВ

При осуществлении эпидемиологического надзора за холерой направления на анализ и соответственно ответ ца него оформляют индивидуально на каждого больного. При проведении большого объема обследований на холе­ру больных острыми кишечными заболеваниями в очаге направления на анализы и ответы на них оформляют на группу больных. При обследовании здоровых людей на вибриононосительство и исследовании на возбудителей холеры объектов окружающей среды групповые формы направления и ответов допускаются как при эпиднад-зоре, так и в очаге холеры. Учет анализа и культур про­водят по установленным формам. Формы направлений и ответов представлены в приложении 6. Обязательным является ведение рабочих записей исследования подо­зрительных культур. При работе в очаге холеры исполь­зуют упрощенные формы регистрации анализов, учиты­вая, что более подробные сведения имеются в бланках направлений, находящихся в лаборатории по ликвида­ции очага. Для удобства работы направления за каж­дый день подшивают отдельно.

Ответ о положительном результате исследования может быть предварительным и окончательным.

Предварительный положительный ответ дают по ре­зультатам ускоренной диагностики (иммунолюминесцен-ции, реакции иммобилизации и микроагглютинации, РПГА) и ориентировочной реакции агглютинации вы­деленной культуры (сообщают о нем устно и только при срочных анализах).

Окончательный положительный ответ выдают на эта-"ах исследования по данным идентификации выделен-чой культуры или ускоренной диагностики нативного ^териала методом развернутой агглютинации з !% Пептонной воде и в пробе с диагностическим бактерио­фагом. Окончательный положительный ответ может быть дан на 1—2-ом этапах исследования в пределах °-—8 ч по данным ускоренного исследования первичного 'Материала (от больных с типичной клиникой холеры) и ^аа 2—7-ом этапах в пределах 18—48 ч по данным пол-його исследования при круглосуточной работе.

Отрицательный ответ может быть дан на 5—7-ом ^апах в пределах 36—48 ч (при круглосуточной рабо-

те) только по результатам исследования материала по полной схеме. При односменной работе с использовани­ем теллурита калия и полиуглеводных сред продолжи­тельность анализа 3—4 сут.

Окончательный положительный ответ сообщают уст­но и письменно, отрицательный — письменно.

7. ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИИ

Бактериологические исследования на возбудителей ^! холеры материала от больных острыми кишечными за- ;

болеваниями и определенных контингентов здоровых ' людей осуществляют лаборатории госпиталей, СЭО ( гарнизонов, СЭО армий, СЭО округов (флотов, групп войск), отдельных противочумных отрядов. Бактерио- ' логические исследования на возбудителей холеры мате- . риала из объектов окружающей среды (воды и др.) про­водят санитаряо-эпидемиологические лаборатории диви­зии (корпуса), СЭО гарнизонов, СЭО армий, СЭО ок­ругов (флотов, групп войск), отдельных противочумных • отрядов.

Исследование материала от больных и умерших с подозрением на холеру могут проводить только лабо­ратории, имеющие разрешение на работу с материалом, ^! подозрительным на зараженность возбудителем холеры. При отдаленности таких лабораторий исследование на- ', чинают в лаборатории госпиталя, СЭО гарнизона, СЭО армий или местных санитарно-эпидемиологических стан­ций, куда немедленно направляют специалистов отдела особо опасных инфекций СЭО округа (флота, группы войск) или противочумных учреждений.

Исследования в лабораториях госпиталя, СЭО гар­низона, СЭО армий, СЭЛ дивизии ведут до установле­ния отрицательного результата анализа или выделения культуры с характерным ростом на агаре и полиуглевод­ной среде или положительной реакцией на оксидазу. Та­кие культуры проверяют в мазке, окрашенном по Гра-му, на подвижность и в реакции агглютинации на стек­ле с холерной 01 сывороткой 1 : 50 и 1:100 (см. рис.). При положительной агглютинации немедленно сообща­ют в отдел ООИ СЭО округа (флота, группы войск) или в противочумное учреждение. Там решают вопрос о порядке окончательной идентификации выделенной культуры: заканчивают на месте прибывшие специали­сты или культуру немедленно доставляют в специали­зированную лабораторию в установленном порядке.

При получении отрицательного результата в реакции агглютинации с холерной 01 сывороткой культуру на­правляют для дальнейшей идентификации в отдел ООИ СЭО округа (флота, группы войск): выделенную от больного — немедленно, от здоровых людей и из окру­жающей среды — не позднее 5 дней после выделения. Культуры из окружающей среды, неагглютинирующиеся на стекле холерной 01 сывороткой, могут быть иденти­фицированы по родовым признакам на месте.

Целесообразность изучения таксономических тестов для культур, подозрительных на вибрионы, неагглюти­нирующихся на стекле холерными диагностическими сыворотками, выделенных из проб воды при осуществ­лении эпидемиологического надзора, определяет еже­годно для конкретных объектов территориальное про­тивочумное учреждение Министерства здравоохранения СССР.

Лаборатории ООИ СЭО округов (флотов, группы войск) выполняют полное диагностическое исследова­ние материала от больных с подозрением на холеру,. трупов, умерших от острых кишечных заболеваний, проб из окружающей среды и проводят идентификацию культур, выделенных в лаборатории СЭО гарнизона (армии) и СЭЛ дивизии (корпуса), определяя их при­надлежность к виду V. cholerae 01 и биовару, с изуче­нием вирулентности холерных вибрионов 01 по гемоли-тической активности и чувствительности к монофагам ХДФ. Культуры, свойства которых не позволяют четко идентифицировать их в соответствии с установленной схемой, направляют в противочумное учреждение. Культуры холерного вибриона 01 независимо от их проис­хождения передают в лабораторию территориального. противочумного учреждения Министерства здравоохра­нения СССР для дальнейшего изучения; все культуры Ядерных вибрионов, требующие изучения вирулентности на лабораторных животных, — сразу после их выделения; остальные — в течение недели после окончания ентификации.

Подробно вопросы организации лабораторных иссле­дований на холеру, включая работу в очаге холеры, из-°Жены в специальных методических рекомендациях приложение 10, пп. 1, 3, 4).

Лаборатории госпиталей, СЭО гарнизона, СЭО ар­мии, СЭЛ дивизии (.корпуса), выполняющие бактерио­логические исследования на возбудителей холеры при эпидемиологическом надзоре, должны иметь разреше­ние на работу с возбудителями 3—4-й группы патоген-ности, строго .выполняя предусмотренный для этих групп микроорганизмов противоэпидемический режим работы в соответствии с Инструкцией о противоэпидемическом .режиме работы, правилах техники безопасности и про­изводственной санитарии при работе с возбудителями инфекционных заболеваний 3—4-й группы в лаборато­риях медицинских учреждений Министерства обороны СССР (приложение 10, п. 2).

Лаборатории отдела ООИ СЭО округа (флота, группы войск), отдельного противочумного отряда, а также лаборатории других учреждений, работающие с возбудителем холеры, руководствуются Инструкцией о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность воз­будителями инфекционных заболеваний 1—2-й группы (приложение 10, п. 2).

Для .всех лабораторий, выполняющих исследования на холеру, обязательными являются требования, изло­женные в Инструкции о порядке учета, хранения, отпу­ска и пересылки культур, бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения в медицинских уч­реждениях Министерства обороны СССР (приложение

10, п. 2).

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ НА ХОЛЕРУ

КОНСЕРВИРУЮЩАЯ (ТРАНСПОРТНАЯ) СРЕДА

Щелочная консервирующая жидкость с морской со­лью Венкатрамена и Рамакришнана. Основной раствор:

борную кислоту (12,4 г) и хлорид калия (14,9 г) раст­воряют в 800 мл горячей дистиллированной воды, ох­лаждают и доводят до 1 л. Рабочий раствор: основной раствор — 250 мл и 0,8% 5/М NaOH—133,5 мл дово­дят до 1 л и добавляют 20 г высушенной морской соли. Доводят рН жидкости до 9,2, отфильтровывают через фильтровальную бумагу, разливают по 10 мл в сосуды с привинчивающимися пробками (с широкими горлыш­ками) и стерилизуют в автоклаве 15 мин под давле­нием 1 кгс/см².

Можно использовать эту жидкость в следующих мо­дификациях:

а) неочищенная морская соль — 20 г, пептон — 5 г, дистиллированная вода — до 1 л (рН 8,6—8,8);

разливают по 10—15 мл в пробирки с широким горлом с плотно закрывающимися резиновыми пробками;

б) 2% раствор поваренной соли: 20 г хлорида нат­рия и 0,1 г гидроксида натрия растворяют в 1 л дистил­лированной воды; жидкость фильтруют через бумажный фильтр, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют в автоклаве 2 мин под давлением 0,7 кгс/см².

СРЕДЫ ОБОГАЩЕНИЯ (НАКОПЛЕНИЯ) Основной раствор пептона (10% пептонная вода).

Состав: пептон — 100 г, хлорид натрия — 50 г, нитрат калия — 1 г, карбонат натрия — 25 г, дистиллирован­ная вода — 1 л, рН 8,0—8,2.

В холодную дистиллированную воду погружают пеп­тон, хлорид натрия, карбонат натрия. Смесь кипятят при постоянном помешивании до полного растворения пептона, не допуская его пригора.ния, затем добавляют нитрат калия. Проверяют реакцию среды; доводят рН До 8,0—8,2. Раствор фильтруют через миткалевый или бумажный фильтр, разливают в посуду и стерилизуют ^в автоклаве 20 мин под давлением 1 кгс/см². Основной Раствор пептона сохраняется до 2 лет.

Основной пептон сухой. Среда представляет собой смесь сухих компонентов оригинальной прописи. Пита­тельную основу его составляют ферментативный пептон

и дрожжевой экстракт. Способ приготовления среды указан на этикетке банки (Московский НИИ им. Меч­никова).

1 % пептонная вода. Для получения 1 % пептонной воды концентрированный раствор (основной раствор пептона) разводят в 10 раз дистиллированной водой. После установления рН 8,2—8,4 разливают среду в пробирки или во флаконы и стерилизуют 20 мин под давлением 0,7 кгс/см². 1 % пептонную воду можно гото­вить .и непосредственно из отдельных компонентов, взяв навески в 10 раз меньше указанных в рецепте основного пептона. Технология приготовления такая же, как и ос­новного пептона.

Пептонная вода с теллуритом калия. В 1 % пептон­ную воду (рН 8,6—9,0) после автоклавирования добав­ляют теллурит калия в конечном разведении 1:100 000 или 1:200000. Срок хранения среды при температуре 20—25° С — 48 ч, при 4° С — 10 сут.

ПЛОТНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ

Щелочной мясопептонный агар. Состав: мясная во­да — 1л, пептон — 10 г, хлорид натрия—5 г, агар-агар — 20 г, рН — 7,8—8,2. В мясную воду вносят пептон и хлорид натрия. Смесь перемешивают и подще­лачивают 20% раствором гидроксида натрия до рН 8,3—8,4. Затем добавляют агар-агар и содержимое по­мещают в автоклав для варки среды вначале текучим паром 30—40 мин, затем 20 мин под давлением 1 кгс/см².

Если мясопептонный агар варят на плите, среду ки­пятят до полного расплавления агар-агара при постоян­ном помешивании. Для получения прозрачной агаровой среды ее после варки в целях отстоя оставляют на 2— 3 ч (лучше 18—20) в автоклаве или помещают в термо­статную комнату при температуре 40—45° С. За время отстоя грубые частицы выпадают в осадок и агар освет­ляется. Для предотвращения быстрого остывания сре­ды посуду с агаром обертывают. Отстоявшийся агар ос­торожно сливают с осадка на плотный ватно-марлевый фильтр. В фильтрате уточняют реакцию среды, если требуется, подкисляют ее, но подщелачивать агар на данном этапе не рекомендуется во избежание попада­ния осадка при стерилизации. Профильтрованный агар разливают в посуду и стерилизуют 20 мин под давлени­ем 0,7 кгс/см².

Щелочной агар сухой на основе ферментативного пептона с дрожжевым экстрактом (Московский НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова). Способ при-Iготовления среды указан на этикетке.

Агар щелочной сухой — на питательной основе из ка­зеинового или дрожжевого гидролизата (Иркутский . противочумный институт). Способ приготовления среды указан на этикетке.

Агар щелочной дрожжевой сухой — на питательной основе из гидролизата кормовых дрожжей, полностью растворимый (Ставропольский НИИ вакцин и сыворо­ток). Способ приготовления среды указан на этикетке.

Агар TCBS. Сухая среда для диагностики холеры (рН 8,6), выпускается фирмой «Дифко» (Детройт, США) и фирмой «Оксоид» (Лондон). На 2 л дистилли­рованной воды берут определенную навеску сухой сре­ды, нагревают до кипения (до полного растворения). Среду, не стерилизуя, разливают в чашки Петри. На зеленом фоне среды колонии холерных вибрионов имеют желтую окраску.

Щелочной агар с вторичными алкилсульфатами нат­рия. В состав щелочного питательного агара Мартена или Хоттингера (рН 7,8—8,2) до стерилизации вводят 0,1—0,2% препарата «Прогресс» (водный раствор вто­ричных алкилсульфатов 'натрия). Среду стерилизуют 20 м.ин под давлением 0,5 кгс/см². Препарат вносят в расплавленный агар, хорошо размешивают и после 10-минутного кипячения с последующим охлаждением раз­ливают по чашкам.

Агаровая элективная среда Касаткина (среда «К»). Состав: пептон — 10 г, дрожжевой экстракт — 40 мл (или сухой 5 г), хлорид натрия — 10 г, карбонат нат­рия — 1 г, 20% водный раствор вторичных алкилсуль-фатов натрия («Прогресс») — 2 мл, теллурит калия — 5 мг, агар-агар (порошкообразный тафуинский) — 15 г, дистиллированная вода — до 1 л, рН—8,5—8,7. Агар-агар и пептон заливают небольшим количеством холодной дистиллированной воды и тщательно переме­шивают до полного смачивания. Затем к смеси добавля­ют остальное количество воды, хлорид натрия, карбо­нат натрия и кипятят содержимое до полного расплав­ления агара (3—5 мин). После этого в состав среды вво-Дят дрожжевой экстракт, «Прогресс» и теллурит калия. Среду вновь кипятят 2—3 мин, а затем без фильтрации и стерилизации разливают в чашки Петри (можно не-

стерильные). При заготовке впрок среду следует раз­ливать в стерильные флаконы и не подвергать в даль­нейшем стерилизации. Срок хранения среды — 1 мес в темном прохладном месте.

Цветная среда «К» (цветная среда Касаткина, 1972). Готовится как среда «К», но на последнем этапе ее из­готовления одновременно с «Прогрессом» и теллуритом калия дополнительно в 1 л среды вносят 20 г сахарозы и 0,4 г бромтимолового синего. Цвет готовой среды — голубой. Колонии холерных вибрионов имеют на среде желтый цвет с темным центром.

СРЕДЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИБРИОНОВ

Лактозо-сахарозная среда. Состав: пептон—5 г, хло­рид натрия 5 г, лактоза — 10 г, сахароза — 1 г, агар-агар — 10 г, индикатор Андреде — 40 мл, вода дистил­лированная — 1 л, рН — 7,2—7,4. Среду варят, филь­труют, разливают по 5—7 мл в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под давлением 5 кгс/см². Готовую среду после стерилизации скашивают тар;, чтобы полу­чить столбик и косяк (по типу среды Ресселя). Среда светлая. При отсутствии пептона среду готовят на 1— 1,3% агаре Хоттингера (с аминным азотом 50—60 мг%) или другом питательном агаре, добавляя к нему угле­воды в соответствующих концентрациях и индикатор Андреде в количестве 2%.

Среда Клиглера. Состав: 1,5—1,7% мясопептонный агар или агар Мартена (рН 7,6—7,8) — 1 л, лактозы— 10 г, сахарозы — 10 г, глюкозы — 1 г, 2% раствор сер­нокислого закисного железа — 10 мл, 0,8% раствор тиосульфата натрия — 10 мл, 0,4% раствор сульфата натрия — 10 мл, 1% раствор фенолового красного — 24 мл, рН—7,2—7,4. Вначале в расплавленном пита­тельном агаре (рН 7,6—7,8) растворяют углеводы, за­тем к нему добавляют свежеприготовленные растворы железа и солей натрия согласно прописи среды (инди­катор на сероводород). Затем вносят индикатор фено­ловый красный. Среду варят, фильтруют, разливают по 5—7 мл в стерильные пробирки, стерилизуют 20 мин под давлением 0,5 кгс/см² и скащивают по типу среды Ресселя. Готовая среда имеет красный цвет.

Среда Клиглера сухая. Способ приготовления ука­зан на этикетке.

Среда Ресселя. Готовится так же, как и лактозо-сахарозная среда, но вместо сахарозы берут глюкозу з

том же количестве.

Среды Гисса. Состав: пептон — 10 г, хлорид нат­рия — 5 г, углевод — 5—10 г, индикатор Андреде — Ю мл или 1,6% раствор бромтимолового синего — 1 мл, вода дистиллированная — 1 л, рН — 7,2—7,4. К 1 % пеп-

•тонной воде (рН 7,2—7,4) без селитры с 0,5% хлорида натрия добавляют 0,5—1% необходимого углевода (L-арабиноза, D-манноза, D-сахароза, D-маннит, D-глюко-за и пр.) 'и 1% индикатора Андреде или 0,1 мл 1,6% раствора бромтимолового синего на 100 мл среды. Сре­ды разливают в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин под давлением 0,5 кгс/см²; среду с L-арабинозой следует стерилизовать в течение 20 мин под давлением 0,1—0,2 кгс/см². Для приготовления сред Гисса можно применять только перечисленные изомеры углеводов. Готовые среды Гисса с индикатором Андреде

. светлые, при кислотообразовании краснеют. Среды с бромтимоловым синим зеленого цвета с травянистым оттенком, при кислой реакции — желтого цвета, при ще­лочной — синего.

Среда Хью-Лейфсона. Состав: пептон — 2 г, хлорид натрия — 5 г, двузамещенный фосфат калия — 0,3 г,глюкоза — 10 г, бромтимоловый синий — 0,03 г, агар-агар •— 3 г, вода дистиллированная — 1 л, рН—7,1— 7,2. К воде добавляют пептон, хлорид натрия и агар-агар. Смесь подогревают до расплавления агара, затем вносят двузамещенный фосфат калия и глюкозу, про-, должают кипятить 2—3 мин. Смесь подщелачивают- 20% раствором гидрокоида натрия до рН 7,4—7,5, дово­дят объем среды до первоначального и добавляют 3 мл 1% водного раствора бромтнмолового синего. Затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разли­вают по 4—5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под давлением 0,5 кгс/см². Цвет среды до сте­рилизации синий, а после автоклавирования — травя­нисто-зеленый (рн 7,1—7,2), но не желтый. При кислой реакции среда желтеет.

Бульон Кларка. Состав: пептон — 5 г, глюкоза — ⁰ г, двузамещенный фосфат калия — 5 г, вода дистил­лированная — 1 л. Смесь ингредиентов нагревают до Яолного их растворения, затем фильтруют через бумаж­ки фильтр и разливают по 5 мл в стерильные пробир-^кй. Бульон стерилизуют 20 мин под давлением ".S кгс/см².

Среда с крахмалом и индикатором. В 1 % пептонную воду для цветного ряда добавляют 1% растворимого крахмала и 1 % индикатора Андреде. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под дав­лением 0,5 кгс/см². Среда светлая, при наличии кислоты краснеет.

Среда с желатиной. К мяоопептонному бульону или бульону Хотти.нгера прибавляют мелко нарезанную же­латину из расчета 10—15 г на 100 мл (летом концентра­цию желатины увеличивают на 20%). Желатина набу­хает в течение 30 мин, а затем ее растворяют при мед­ленном нагревании на водяной бане при температуре 40° С. Устанавливают рН 7,0, прибавляя к расплавлен­ной желатине 10% раствор двууглекислого натрия. При более щелочной реакции желатина застывает плохо, а иногда и совсем не застывает. В 1 л растворенной же­латины вносят для просветления два взбитых с неболь­шим количеством дистиллированной воды яичных бел­ка. Смесь перемешивают и прогревают текучим паром в течение 20 мин до полного свертывания белка и про­светления среды. Затем среду фильтруют в горячем сос­тоянии через бумажный или тонкий ватно-марлевый фильтр с большой поверхностью. Среду, разлитую по 5—8 мл в пробирки, стерилизуют дробно 3 дня по часу текучим паром или однократно 20 мин под давлением 0,5 кгс/см². После стерилизации среду охлаждают, по­гружая пробирки в холодную воду в строго вертикаль­ном положении, чтобы верхняя часть столбика при за­стывании оставалась совершенно ровной.

Среда пептонно-дрожжевая для определения декар-боксилаз и дегидролаз аминокислот. Состав: пептон — 5 г, дрожжевой экстракт — 25 мл (сухой 3 г), глюко­за — 1 г, хлорид натрия — 5 г, карбонат натрия (без­водный) — 0,1 г, бромтимоловый синий (0,1% раствор з 20% спирте) — 45 мл (0,045 г сухого), аминокислота — 10—20 г, вода дистиллированная — 1 л, рН — 6,4— 6,5. Среда из сухих компонентов может быть приготов­лена в сухом виде. Все ингредиенты по прописи выше­указанной среды, кроме аминокислот, растворяют при нагревании, устанавливают рН 6,4, затем добавляют со­ответствующий индикатор и делят среду на 4 равные части. В одну часть аминокислоты не добавляют, эта порция служит контролем. В остальные порции вносят соответственно: в первую — 1% лизина, во вторую — 1% орнитина, в третью — 1% аргинина. Аминокислоты должны быть в L-форме. Аминокислоты в DL-форме до­бавляют в количестве 2%, т. к. бактерии используют только L-форму аминокислот. Перед стерилизацией в случае необходимости исправляют рН среды 0,1% раст­вором НС1. Среду разливают по 1—2 мл в химически чистые стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под давлением 0,1—0,2 кгс/см². Небольшое количество флэ-кулята в средах не имеет значения. Среда имеет травя­нисто-зеленый цвет, при кислой реакции — желтеет, при щелочной — синеет.

Среда с мочевиной (Кристенсена). Состав: пептон — 1 .г, хлорид натрия — 5 г, однозамещенный фосфат ка­лия — 2 г, глюкоза — 1 г, фенолрот — 0,012 г, агар-агар — 20 г, мочевина — 20 г, вода дистиллированная— 1 л, рН — 6,8. Предварительно промытый агар-агар или порошкообразный тафуинский вносят в воду и на­гревают до расплавления. Затем добавляют пептон, со­ли и глюкозу, дают агару вскипеть, после чего вносят ^! фенолрот, предкаритг.лык) растворенный в 0,1% раство-" ре гидроксида натрия. Учитывают количество щелочи, ; ушедшей на растворение индикатора, и. приливают к | f смеси остальное ее количество для общего объема 25 мл. ^; Дают всей смеси вновь закипеть. Среду разливают по "5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют 20 мин под •давлением 0,5 кгс/см². После охлаждения среды до тем­пературы 50° С в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 20% раствора мочевины (20 г мочевины растворяют в стерильной дистиллированной воде и кипятят на водя­ной бане в течение 30 мин). Полученную среду охлаж­дают в наклонном положении для получения скошенного агара. Цвет готовой среды — желтовато-зеленый. При Щелочеобразовании цвет среды изменяется от желтова­того до красно-фиолетового.

ПОРЯДОК КОНТРОЛЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Качество плотных и жидких питательных сред проверяют территориальные противочумные учреждения Министерства здравоохранения СССР, используя для .контроля штамм V. cholerae 01 или лаборатории отдела особо опасных инфекций СЭО округа (флота, группы ьойск)и отдельного противочумного отряда с использо­ванием штамма НАГ-вибриона. В зависимости от кон­кретных условий контроль питательных сред осущест­вляют лаборатории отделов ООИ СЭО округа (флота,

группы войск), ПЧО или территориальных противочум­ных учреждений.

Бактериологическому контролю подлежит одна вар­ка каждой серии среды, приготовленной в конкретных . условиях. Оптимальный срок проверки питательных сред — Ю—14 сут после их приготовления. Повторный контроль серии осуществляют ежегодно, а также в слу­чаях изменения условий средоварения. На проверку направляют часть рабочего объема готовых питательных сред в количестве 200 мл щелочного агара и 100 мл основного раствора пептона. На этикетке указывают название среды, № серии и время варки. Каждая серия теллурита калия должна быть проверена на ингибирую- ] щие свойства 'в 'отношении холерных вибрионов и ки­шечной палочки.

Контроль качества питательных сред и теллурита ка­лия проводят по специальной инструкции (приложение 10, п. 1).

Результаты контроля сообщают письменно. При по­лучении положительного результата контроля пробы со­ответствующая серия ср.еды считается пригодной к ра­боте при тех же условиях приготовления. Если при пер­вом контроле среда оказалась непригодной, необходимо направить повторно на бактериологический контроль эту же серию сухой среды и образец новой варки из нее. При получении отрицательного результата повторного контроля среды, приготовленной на месте, и положи­тельного результата бактериологического контроля об­разца этой же серии сухой среды, сваренного в лабора­тории контролирующего учреждения, считать данную серию сухой питательной среды пригодной и принять меры к выяснению и устранению ошибки в технологии местного изготовления. При получении отрицательного результата на образец сухой среды данной серии на­правляют рекламацию в адрес института изготовителя. Бактериологический контроль образцов питательных сред, приготовленных на мясной основе, проводят в том же порядке, исключая исследование сухого образца.

^ Полиуглеводные среды, используемые для отбора колоний, проверяют на местах.

Срок хранения готовой среды щелочного агара 3 мес, основного раствора пептона 6 мес с момента проверки. По истечении этого срока питательные среды данной се­рии направляются на переконтроль.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

Нормы расходования диагностических препаратов и питательных сред на 1 анализ при исследовании на холеру

Диагностические препараты и питательные среды	Единицы измерения	Абсолютные нориы для анализа с полным исследованиемга е u	Средние нормы при массовом исследовании
Холерная агглютинирующая сыворот­	МЛ	0,2	0,015
ка 0
Холерная агглютинирующая сыворот­	мл	0,2	0,01
ка Огава
Холерная агглютинирующая сыворот­	мл	0,2	0,01
ка Инаба
Холерная агглютинирующая сыворот­	мл	0,1	0,015
ка RO
Холерные диагностические фаги:
холерный	мл	0,1	0,002
Эль-Тор	мл	0,1	0,002
Холерная люминесцирующая сыворот­	мл	0,03	0,0005
ка
Агар-агар	г	0,5	0,01
Агар щелочной:
сухой агар	г	5	2,5
готовая среда	г	100	50
Агар мясопептонный рН 7,2	г	25	15
Бульон мясопептонный	мл	2	0,1
Основной раствор пептона (10% пеп-
тонная вода):
анализ материала от людей	г	10	5
анализ воды	мл	110	110
Сахароза	мл	0,5	0,15
Манноза	мл	0,5	0,001
'Арабиноза	мл	0,05	0,001
Лактоза	мл	0,05	0,15
Глюкоза	мл	0,1	0,01
Теллурит калия:
анализ материала от людей	мл	0,001	0,001
анализ воды	мл	0,015	0,015

, - ПРИЛОЖЕНИЕ 5

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для серологической диагностики холеры, обследова­ния переболевших, вибриононосителей и вакцинирован­ных лиц используют иммунологические реакции, выяв­ляющие в сыворотке крови специфические агглютинины, вибриоцидины, антитоксины.

У больных холерой •на 5—7-й день после начала заболевания появляются агглютинины и вибриоцидные антитела в высоких титрах. Титры антитоксинов нара­стают более медленно.

Исследовать надо парные сыворотки с интервалом 7—Ю дней. Первая проба должна быть взята на 1—3-й день болезни, вторая — в период с 7-го по 14-й день.

Кровь для серологических исследований берут из вены, а при отсутствии такой возможности или при ра­боте в полевых условиях — из пальца. Из вены берут 1—5 мл крови и после свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной палочкой или платино­вой петлей. Пробирки сохраняют в холодильнике и тран­спортируют в лабораторию охлажденными (в термосе, сумке-холодильнике и др.). В лаборатории сыворотку ииактивируют при температуре 56° С в течение 30 мин.

Если кровь забирают в день постановки реакции, пробирки со свернувшейся кровью необходимо центри­фугировать 10—15 .мин при 3000 об/мин. При отсут­ствии возможности исследовать сыворотку немедленно ее сохраняют в ампулах при температуре 4° С.

Из пальца кровь берут пипеткой в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый флакон или про­бирку с 1,6 мл 0,9% раствора хлорида натрия (1:5).

При работе 'в полевых условиях несколько капель капиллярной крови из пальца наносят на лист просте-рилизованной фильтровальной бумаги, подсушивают при комнатной температуре, помещают в пробирку и направ­ляют в лабораторию. При исследовании кружки бумаги с каплями крови вырезают и заливают каждый кружок 0,9 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия (разведение 1 : 10) и после 3—4 ч экстрагирования в ус­ловиях холодильника инактивируют 30 мин при тем­пературе 56° С и исследуют.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТИВОХОЛЕРНЫХ АНТИТЕЛ Ц МЕТОДОМ РАЗВЕРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

Ц Исследуемую сыворотку разводят 1% пептонной водой (рН 7,4—7,6) в объеме 1 мл от 1 : 10 до 1 : 640. В Укачестве антигена используют 3-часовую культуру, вы­деленную в данном очаге, или исследуют в двух рядах с культурами сероваров Огава и Инаба. В пробирку с раститрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры (антигена) и ставят на 1 ч в термостат, затем до утра в холодильник при температуре 4° С, после чего отмеча­ют результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки. При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3—4 креста. Результат исследования сыворотки больного при положительной реакции агглютинации в разведении 1:40 |и выше считается ориентировочно положительным. Диагностическое значение имеет только 4-жрестный или ^более высокий подъем титров антител.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТИВОХОЛЕРНЫХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ ФАЗОВО-КОНТРАСТНОИ МИКРОСКОПИИ

Агаровую 10—24-часовую культуру индикаторного 1'штамма суспендируют в небольшом объеме (около "0,5 мл) 0,9% раствора-хлорида натрия (густота взвеси примерно 3—4 млрд м. т.'в 1 мл по оптическому стан­дарту ГИСК). В качестве индикаторного штамма следу­ет 'использовать выделенный в данном очаге штамм или музейный штамм того же биовара и серовара. Индика­торные штаммы должны быть типичными по всем ос­новным свойствам, феномен микроагглютинации под фазово-контрастным микроскопом с холерной О-сыво-ротоой должен идти не менее чем '/4 титра.

На хорошо обезжиренное предметное стекло наносят большой бактериологической петлей каплю взвеси ин­дикаторного штамма, накрывают покровным стеклом и рассматривают в фазово-контрастном микроскопе с объективом 4^х. Наблюдают характерную морфологию и подвижность холерного вибриона.

На другое предметное стекло наносят большой бак­териологической петлей каплю испытуемой сыворотки, взятую этой же петлей (после ее прожигания), каплю взвеси индикаторного штамма смешивают с каплей сы­воротки, накрывают покровным стеклом и рассматри­вают так же, как и контрольный препарат. При наличии ⁸ испытуемой сыворотке специфических а:нтител наблю-

дают склеивание вибрионов (образование конгломера­тов) и иммобилизацию их (прекращение активного дви­жения). Оценку интенсивности реакции проводят сле­дующим образом:

а) ++++—к началу просмотра препарата почти все вибрионы склеены в компактные конгломераты;

б) + + + — конгломераты образуются с некоторой задержкой (2—4 мин), но такие же компактные, как

и в случае + + + +;

в) + + — образование рыхлых 'и меньших по разме­ру конгломератов на протяжении 4—6 мин после кон­такта взвеси культуры с сывороткой, в поле зрения много изолированных вибрионов;

г) — — иммобилизация основной массы вибрионов в течение 4—6 мин без образования конгломератов.

Сыворотки, в которых наблюдалось образование конгломератов (с оценкой не ниже чем на ++), сле­дует раститровать так, чтобы получить разведения 1: 5, 1:10, 1 ; 20, 1 : 40, 1 : 80 (для разведения 1 : 5 можно взять 0,4 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 0,1 мл сы­воротки, тогда дальнейшие разведения делают в объеме 0,2 мл). Разведения сывороток исследуют точно так же, как и нативную сыворотку.

Учету как «положительная реакция» в том или ином разведении подлежат лишь реакции, оцениваемые не ниже чем на ++. При этом следует иметь з виду, что разведению сыворотки в ряду пробирок соответствует удвоенное окончательное разведение сыворотки на стек­ле (петля разведения сыворотки плюс петля взвеси виб­риона). Таким образом, реакция на стекле с неразве­денной сывороткой оценивается как реакция в разведе­нии 1 :2, с сывороткой в разведении 1 :5—как реакция в разведении 1 : 10 и т. д. Диагностическое значение име­ет положительная реакция с оценкой не ниже чем на + + в разведении 1 : 10 и выше.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ АНТИГЕНА (РНАг) ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХОЛЕРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО

ДИАГНОСТИКУМА

Принцип реакции состоит в специфической нейтрали­зации добавляемого антигена полными и неполными ан­тигенами, содержащимися в исследуемой сыворотке.

Методика постановки и оценки реакций изложена в на­ставлении к диагностикуму холерному иммуноглобули-новому эритроцитарному.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКСИННЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ РЕАКЦИЕЙ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РПГА) ЭРИТРОЦИТАРНЫМ ХОЛЕРНЫМ ЭНТЕРОТОКСИЧЕСКИМ ДИАГНОСТИКУМОМ

Методика реакции и ее учет изложены в специаль­ных методических рекомендациях (приложение 10, п. 1).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИБРИОЦИДНЫХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (РВА)

Вибриоцидины в крови больных обнаруживаются с 1—3-го дня болезни в титрах 10-' и Ю-³ и достигают максимальных значений (Ю-⁴—Ю-⁸) к 10—12-му дню. У переболевших холерой так же, как и у вибриононоси-телей и вакцинированных лиц, титры вибриоцидных ан­тител могут иметь различные показатели (10~¹—Ю-⁸). Принцип метода во всех его вариантах заключается в том, что в присутствии вибриоцидных антител в сыво­ротке не происходит размножения холерных вибриодов. При проведении серологических исследований в очаге, обусловленном возбудителем холеры определенного се-ровара, в реакции используют один штамм соответству­ющего серовара, при отсутствии этих данных — два штамма обоих сероваров.

Материалы и оборудование:

— исследуемые сыворотки, инактивированные про­греванием при температуре 56° С в течение 30 мин;

— сухой комплемент или свежеполученная-сыворот­ка морской свинки в разведении 1 :20;

— 0,9% раствор хлорида натрия рН 7,2;

— штаммы холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба, типичные, в S-форме, не чувствительные к комплементу;

— чашки Петри со щелочным агаром;

— лоток со льдом;

— термостат на 37° С.

Методика постановки реакции. Компле­мент разливают в два ряда пробирок по 0,9 мл. В пер­вую пробирку вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки и

после тщательного перемешивания последовательно пе­реносят по 0,1 мл до разведения Ю-¹⁰, получая десяти­кратные разведения сыворотки в объеме 0,9 мл. Титра-цию сыворотки проводят на льду, который помещают в любую емкость.

Из односуточной агаровой культуры холерного виб­риона готовят взвесь в физиологическом растворе, со­держащую в 1 мл 10000—20000 микробных клеток. Стерильной градуированной пипеткой полученную взвесь по 0,1 мл вносят в опытные пробирки с раститро-ванной сывороткой. Необходимы следующие контроли:

контроль комплемента (0,9 мл комплемента и 0,1 мл культуры); контроль сыворотки (0,8 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,1 мл сыворотки и 0,1 мл культуры);

контроль культуры (0,9 мл 0,9 % раствора хлорида нат­рия и 0,1 мл культуры).

Штатив с пробирками на 1 ч помещают в водяную баню или термостат при температуре 37° С, сделав пред­варительно высев из пробирки контроля культуры для определения фактической концентрации живых вибрио­нов в опытной суспензии (контроль разведения). Через 1 ч штатив вновь ставят на лед и из каждой пробирки отдельной стерильной пипеткой 0,1 мл культуры высе­вают на чашку с щелочным агаром (рН 7,6). Посев рав­номерно распределяют по поверхности чашки покачива­нием 'или шпателем. Чашки помещают на 18—24 ч в термостат при температуре 37° С, после чего подсчи­тывают количество выросших колоний. В посевах из контрольных пробирок должно вырасти количество ко­лоний, близкое к контролю разведения. Вибриоцидным титром считают максимальное разведение сыворотки, которое вызывает гибель не менее чем 50% клеток хо­лерного вибриона, что выявляется при посеве на агаро­вые пластинки в чашки Петри по сравнению с количе­ством выросших колоний из пробирки контроля компле­мента.

Пример вычисления: при посеве из опытных проби­рок с разведением сыворотки 10~¹, Ю-², Ю-³, Ю-⁴, Ю-⁵, 10~⁶, 10~⁷ и т. д. на чашках соответственно выросло О, О, 5, 10, 15, 30, 38 и т. д. колоний. При высеве из про­бирки .контроля комплемента также после часовой ин­кубации при температуре 37° С выросло 36 колоний, ог которых 50% будут составлять 18 колоний. Из 5-й про­бирки выросло 15 колоний, т. е. менее 50% количества колоний в контроле (18), из следующей 6-й пробирки

06

. выросло 30 колоний, т. е. более 50% этого же показа-; теля. Разведение сыворотки в 5-й пробирке составляет Ю-⁵, следовательно, вибриоцидный титр в данном при-'- мере будет составлять 10~⁵.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИБРИОЦИДНЫХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТАЦИИ УГЛЕВОДОВ

Принцип метода: об отсутствии или наличии внбрио-' цидных антител судят по ферментации сахарозы, реги-;• стрируемой по изменению окраски индикатора. У Материалы и оборудование:

— сыворотка крови, взятая из вены 'или пальца, инактивированная при температуре 56° в течение

• 30 мин;

— штаммы холерного вибриона сероваров Огава и Инаба;

? — комплемент, разведенный 1:20 1% раствором [.пептона, содержащим 1% сахарозы и 1% индикатора S Андреде;

— термостат на 37° С.

Методика постановки ре. акции. Раствор комплемента с углеводом и индикатором разливают в I пробирки по 0,45 мл. В первую пробирку добавляют | 0,05 мл исследуемой сыворотки и после тщательного |. перемешивания переносят 0,05 мл смеси во вторую про-j бирку, из второй в третью и т. д. (до разведения сыво-| ротки Ю-⁸—Ю-⁹). Готовят суспензию 18—20-часовой 1/агаровой культуры холерного вибриона и разводят 1% i|пептонной водой до концентрации 10³ м. к. в 1 мл. Во |;вое пробирки вносят по 0,45 мл суспензии и помещают |в термостат при 37° С. Постановку реакции сопровожда-|ют следующими контролями:

— 0,45 мл 1 % пептона, содержащего 1 % сахарозы |:и 1% индикатора Андреде + 0,05 мл исследуемой сыво-^•ротки + 0,45 мл взвеси культуры — контроль сыво-;ротки;

— 0,45 мл комплемента с сахарозой и индикато-; ром + 0,45 мл культуры—контроль комплемента;

— 0,45 мл 1 % пептона с сахарозой и индикато-

• ром + 0,45 мл культуры—контроль культуры;

— 0,45 мл 1 % пептона с сахарозой и индикато­ром + 0,05 мл исследуемой сыворотки — контроль сте­рильности сыворотки.