7. Простые и сложные методы окраски

Простой метод окраски. Является одноэтапным и заключается в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 1-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.

Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой клеточной стенкой.

Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.

8. Механизмы окрасок по Граму и Цилю-Нильсену

Метод Грама (Gram). Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий. При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при обработке спиртом удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.

Таблица 4 Метод Грама

Этапы окраски		Цвет бактерий
1.	На фиксированный мазок поместить фильтровальную бумажку, пропитанную генцианвиолетом, смочить водой, 2-3 минуты	Все бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет
2.	Снять бумажку, слить с препарата оставшуюся краску и налить раствор Люголя на 1 минуту	Все бактерии остаются фиолетовыми
3.	Для дифференцирования нанести на мазок этиловый спирт в течение 3-6 с, промыть водой	Грамположительные бактерии остаются фиолетовыми, грамотрицательные обесцвечиваются
4.	Нанести фуксин Пффейфера (водный раствор фуксина) на 1-2 мин, промыть водой, высушить	Грамположительные остаются фиолетовыми, грамотрицательные окрашиваются в красный цвет

Метод Циля-Нильсена. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать кислотоустойчивые и некислотоустойчивые бактерии.

Таблица 5 Метод Циля-Нильсена

Этапы окраски		Цвет бактерий
1.	На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина Циля через полоску фильтровальной бумаги и подогреть препарат в пламени горелки до появления паров (повторить 3-4 раза)	Все бактерии окрашиваются в красный цвет
2.	Снять бумагу, промыть мазок водой	Все бактерии остаются красными
3.	Для дифференцирования нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 минуты	Кислотоустойчивые бактерии остаются красными, некислотоустойчивые обесцвечиваются
4.	Нанести водный раствор метиленового синего и докрасить 3-5 мин, промыть водой, высушить	Кислотоустойчивые остаются красными, некислотоустойчивые окрашиваются в синий цвет

Кислотоустойчивые бактерии имеют особое строение клеточной стенки, содержащей большое количество сложных липидов (миколовая и фтиоловая кислоты, воск D, глико- и фосфолипидовы), что делает эти бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Клеточная стенка этих бактерий плохо воспринимает анилиновые красители и обычные способы окраски. Высокая температура в процессе окраски методом Циля-Нильсена расплавляет липиды, фенол разрыхляет клеточную стенку и краситель проникает внутрь клетки. После остывания препарата липиды вновь затвердевают, прочно удерживая краситель, поэтому кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной кислотой и остаются красными. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и их докрашивают контрастным красителем — метиленовым синим. В основном, метод используется для окраски бактерий, относящихся к роду Мусоbacterium (М.tuberculosis, М.bovis, М.leprae и др.)