Лабораторная работа №9 Определение активности гидролитических ферментов

9.1 Цель работы: освоение методов определения активности гидролаз.

9.2 Общие сведения

Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы. Они ускоряют химические превращения в живой клетке.

Ферменты характеризуются ядом особенностей по сравнению с небиологическими катализаторами. Среди этих особенностей такие как:

• высокая каталитическая активность;

• высокая специфичность;

• лабильность.

На активность ферментов влияет относительная концентрация ферментов и субстрата, концентрация водородных ионов, температура, активаторы, ингибиторы.

Ферменты имеют большое практическое значение, так как производство хлеба, молочнокислых продуктов, пива, чая, вина, соков основано на использовании ферментативных процессов. Применение ферментных препаратов в процессе производства продуктов питания открывает огромные возможности повышения их качества.

В зависимости от типа катализируемой реакции их разделяют на шесть классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы.

Класс гидролаз включает большое число ферментов, катализирующих процессы расщепления различных химических связей с присоединением ионов водорода и гидроксила, образующихся при диссоциации воды. Такое расщепление называют гидролизом, а катализирующие его ферменты – гидролазами. Эти ферменты наиболее широко применяются в различных отраслях промышленности.

В зависимости от типа расщепляемой связи гидролазы делят на группы. Например, эстеразы расщепляют сложные эфиры(в эту группу входят липазы, фосфатазы, пектинэстеразы и др.); карбогидразы катализируют расщепление гликозидных связей(амилазы, целлюлазы и др.); протеазы расщепляют пептидную связь(пептин, трипсин, папаин, и др.).

9.3 Практическая часть

9.3.1 Опыт 1. Определение амилазной активности слюны.

Амилазы катализируют гидролиз высокомолекулярных запасных полисахаридов – крахмала и гликогена. Различают α - и β-амилазу. α -Амилаза катализирует гидролиз α -1,4 – глюкозидных связей без определенного порядка с образование декстринов, поэтому ее называют «декстринирующим ферментом». β-Амилаза гидролизует такие же связи, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов полисахаридных цепей, поэтому ее называют «осахаривающим ферментом».

Препараты амилаз широко применяют в пищевой промышленности для получения сусла и крахмальной патоки, а также в хлебопечении – для увеличения количества сбраживаемых сахаров в тесте.

Активность амилазы можно оценить по уменьшению степени полимеризации субстрата, о чем свидетельствует изменение окрашивания при добавлении йода. Окраска изменяется от синей (крахмал и амилодекстрины) до красно-фиолетовой (эритродекстрины), а затем исчезает вовсе (ахродекстрины); желтый цвет раствора обусловлен самим йодом.

Приборы и реактивы: штатив с пробирками; мерные пипетки на 1 мл; мерный цилиндр на 10 мл; бюретки; водяная баня; термометр; 0,1%-ный раствор крахмала; раствор йода в йодистом калии (реактив Люголя); 5%-ный раствор хлористого натрия; 5%-ный раствор сернистокислой меди.