12.3 Практическая часть
12.3.1 Опыт 1. Определение активности полифенолоксидазы
Метод определения активности полифенолоксидазы основан на окислении пирокатехина в присутствии кислорода. Получаемый хинон постоянно подвергается восстановлению аскорбиновой кислотой в исходное вещество, аскорбиновая кислота окисляется в дегидроаскорбиновую.
После окончания ферментной реакции количество оставшейся аскорбиновой кислоты определяется с 2,6-дихлорфенолиндофенолом или йодометрически.
Приборы и реактивы: весы; мерная колба на 100 мл; воронки с фильтрами; мерные цилиндры на 10 мл; конические колбы на 50 мл; бюретки; фосфатный буферный раствор рН 7,38; 0,1%-ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,02 М раствор пирокатехина; 10%-ный раствор фосфорной кислоты; 0,01 М раствор йода; раствор крахмала.
Порядок приготовления фосфатного буферного раствора с заданным значением рН приводится в таблице 24.
Таблица 24 – Смесь Соресена
Состав фосфатной смеси |
РН |
Состав фосфатной смеси |
РН |
||
1/15 М Na2HPO4, мл |
1/15KH2PO4, мл |
1/15 М Na2HPO4, мл |
1/15 KH2PO4, мл |
||
0,10 |
9,90 |
4,94 |
6,00 |
4,00 |
6,98 |
0,25 |
9,75 |
5,29 |
7,00 |
3,00 |
7,17 |
0,50 |
9,50 |
5,59 |
8,00 |
2,00 |
7,38 |
1,00 |
9,00 |
5,91 |
9,00 |
1,00 |
7,73 |
2,00 |
8,00 |
6,24 |
9,50 |
0,50 |
8,04 |
3,00 |
7,00 |
6,47 |
9,75 |
0,25 |
8,34 |
4,00 |
6,00 |
6,64 |
9,80 |
0,10 |
8,67 |
5,00 |
5,00 |
6,81 |
10,00 |
0,00 |
9,18 |
12.3.1.1 Методика выполнения работы
Навеску муки 5 г помещают в мерную колбу на 100 мл и добавляют фосфатный буферный раствор рН 7,38 до метки, настаивают 1,5 – 2 часа и фильтруют. Затем в коническую колбу на 50 мл вносят 1 мл фильтрата, 3 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,1%-ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. Для проведения контрольного опыта берут 1 мл предварительно прокипяченного фильтрата и все реактивы, что в рабочем опыте.
Температура всех компонентов должна быть 18-20оС колбы равномерно встряхивают в течение 15 минут. Затем добавляют 1 мл 10%-ного раствора фосфорной кислоты и титруют 0,01 М раствором йода в присутствии крахмала.
Активность полифенолоксидазы (П) выражают в миллиграммах аскорбиновой кислоты:
П
=
,
где а, b – объем рабочего раствора йода, пошедший на титрование контрольного и рабочего опытов, мл;
Т – масса аскорбиновой кислоты, эквивалентная 1 мл раствора йода, г (0,83);
g – навеска муки, соответствующая 1 мл фильтрата, г (0,05).
12.3.1.2 Оформление результатов опыта
Полученные результаты записывают в таблицу 25.
Таблица 25
Наименование продукта |
а, мл |
b, мл |
Активность полифенолоксидазы, мг |
Вывод |
|
|
|
|
|