Методы стерилизации и дезинфекции в микробиологической лаборатории.

В микробиологической практике применяют различные дезинфицирующие вещества: 0,2% раствор жавель-солида, 3-5% растворы фенола, 5-10% растворы лизола, 1-5% растворы хлорамина, 3-6% растворы перекиси водорода, 1-5% растворы формалина, растворы сулемы в разведении 1:1000 (0,1%), 70% спирт и др.             Дезинфекции подвергают отработанный патологический материал (гной, кал, моча, мокрота, кровь, спиномозговая жидкость) перед сливом его в канализацию. Обеззараживание проводят сухой хлорной известью или 3-5% раствором хлорамина.             Загрязненные патологическим материалом или культурами микроорганизмов пипетки, стеклянные шпатели, предметные и покровные стекла опускают на сутки в стеклянные банки с 0,2% раствор жавель-солида, 3% раствором фенола или перекиси водорода. Препаровальные иглы, бактериальные петли после употребления немедленно прокаливают на огне.

По окончании работы с заразным материалом лаборант должен обработать дезинфицирующим раствором рабочее место и руки. Поверхность рабочего стола протирают кусочком ваты, смоченным 3% раствором фенола. Руки дезинфицируют 1% раствором хлорамина.

Выбор дезинфицирующего вещества, его концентрация и длительность воздействия (экспозиция) зависят от биологических свойств микроба и от той среды, в которой будет происходить контакт дезинфицирующего вещества с патогенными микроорганизмами. Например, сулема, фенол, спирты непригодны для обеззараживания белковых субстратов (гной, кровь, мокрота), так как под их влиянием происходит свертывание белков, а свернувшийся белок предохраняет микроорганизмы от воздействия дезинфицирующего вещества. При дезинфекции материала, инфицированного споровыми формами микроорганизмов, применяют 5% раствор хлорамина, 1-2, 5% растворы активированного хлорамина, 5-10% растворы формалина и другие вещества. Дезинфекцию, которую проводят на протяжении всего дня по ходу работы, называют текущей, а по окончании - заключительной.

Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

• Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С.

• Среды с углеводами и молоком, питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С.

• Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.

• Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Подготовленные к употреблению питательные среды проверяют на стерильность.

Подготовка к стерилизации лабораторной посуды

• Перед стерилизацией лабораторную посуду тщательно моют и сушат.

• Пробирки, флаконы, бутылки, матрацы, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачек.

• Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1-5 штук или в пеналах.

• Пастеровские пипетки по 3-5-10-15 штук заворачивают в плотную оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

Лабораторную посуду стерилизуют:

а) сухим жаром при температуре 150, 160 и 180?С соответственно 2 часа, 1 час и 30 минут. б) в автоклаве при давлении 1 атм. В течение 20-30 минут

ПРИНЦИПЫ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

           Для определения количества микроорганизмов используют различные методы:

1. прямой подсчет под микроскопом в счетных камерах (этот метод применяется крайне редко);

2. количественный посев на плотные среды с последующим подсчетом выросших колоний;

3. титрационный посев на жидкие питательные среды;

4. специальные методы, учитывающие особенности исследуемого материала.

           Количество санитарно-показательных микроорганизмов в исследуемом материале выражают в виде титра или индекса.

Определение микробного числа воды Водопроводную воду засевают в объеме 1см3 (1 мл). Пробу вносят в стерильную чашку Петри, заливают 10-12 мл расплавленного и остуженного до 45°С питательного агара, перемешивают с водой. Посев инкубируют при 37°С в течение 1-2 сут. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине среды колоний и вычисляют микробное число воды - количество микроорганизмов в 1 мл.

Титрационный метод Для исследования водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл в глюкозопептонную среду. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, CitrobacterиEnterobacterот грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Коли-титр воды измеряется минимальным количеством воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП, коли-индекс - количеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды.

Определение микробного числа воздуха

           Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации. Седиминтационный метод. Две чашки Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 60 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37°С. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается чистым; 250-500 колоний - загрязненным в средней степени, при количестве колоний более 500 - загрязненным. Аспирационный метод - более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов (прибор Кротова и пробоотборник ПАБ-1). Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просачивается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью. После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа

Методы стерилизации

• Термическая: паровая и воздушная (сухожаровая)

• Химическая: газовая или химическими растворами (стерилянтами)

• Плазменная (плазмой перекиси водорода)

• Радиационная стерилизация — применяется в промышленном варианте

• Метод мембранных фильтров — применяется для получения небольшого количества стерильных растворов, качество которых может резко ухудшиться при действии других методов стерилизации(бактериофаг, селективные питательные среды, антибиотики)^[1]

Термические методы стерилизации

Преимущества термических методов стерилизации:

• Надёжность

• Отсутствие необходимости удаления стерилянтов с предметов медицинского назначения

• Удобство работы персонала

• Стерилизация проводится в упаковках, что позволяет сохранить стерильность некоторый период времени.

Паровая стерилизация

Осуществляется подачей насыщенного водяного парапод давлением в паровых стерилизаторах (автоклавах).

Паровая стерилизация под давлением считается наиболее эффективным методом, так как чем выше давление, тем выше температура пара, стерилизующего материал; бактерицидные свойства пара выше, чем воздуха, поэтому для стерилизации применяют пересыщенный пар.

Паровой стерилизации подвергают изделия из текстиля (бельё, вату, бинты, шовный материал), из резины, стекла, некоторых полимерных материалов, питательные среды, лекарственные препараты.

Режимы паровой стерилизации

132 °C — 2 атмосферы(2 кгс/см2) — 20 минут — основной режим. Стерилизуют все изделия (стекло, металл, текстиль, кроме резиновых).

120 °C — 1,1 атмосфера(1,1 кгс/см2) — 45 минут — щадящий режим (стекло, металл, резиновые изделия, полимерные изделия — согласно паспорту, текстиль)

110 °C — 0,5 атмосферы(0,5 кгс/см2) — 180 мин — особо щадящий режим (нестойкие препараты, питательные среды)

Упаковочные материалы при паровой стерилизации:

• Стерилизационная коробка (бикс) простая. Срок хранения 3 суток после стерилизации.

• Стерилизационная коробка (бикс) с фильтром. Срок хранения 20 суток после стерилизации.

• Крафт-пакеты со скрепками. Срок хранения — трое суток после стерилизации.

• Крафт-пакеты заклеивающиеся. Срок хранения — 20 суток после стерилизации.

• Ткань (бязь — КРОМЕ МАРЛИ). Срок хранения — трое суток после стерилизации.

• Комбинированные упаковки (прозрачная синтетическая плёнка + бумага)(дгм стеригард). Срок хранения от 180 суток до 720 суток.

Тиндализация

Основная статья: Тиндализация

Тиндализацию применяют для стерилизации растворов, неустойчивых к действию высокой температуры. Она состоит в неоднократном нагревании до температуры 70—100°С с промежутками в 24 ч.

Химические методы стерилизации

Используются при обработке приборов, аппаратов, сложных оптических систем, крупногабаритных изделий или изделий из титана, полимерных смол, резин.

Для газовой(холодной) стерилизации используют герметичные контейнеры с парами окиси этилена, формальдегида или специализированными многокомпонентными системами.

Для химической стерилизации растворами применяются основных четыре группы веществ:

• Кислота+окислитель(например «Первомур»)

• Альдегид(например формалин)

• Детергент(например хлоргексидина биглюконат)

• Галоид(например Повидон-йод)

Концентрации и время стерилизации зависит от используемого антисептика или дезинфектанта.