Приготовление гистологического препарата.

Гистологический анализ включает в себя следующие главные этапы: выбор объекта исследования, подготовку его для изучения под микроскопом (приготовление гистологических препаратов), микроскопирование препаратов (одним или несколькими методами), качественный и количественный анализ микроскопической картины.

Первое из условий приготовления гистологических препаратов обеспечивается своевременным взятием и надлежащей фиксацией исследуемого материала, второе – качественным приготовлением и обработкой срезов, третье – соответствующей окраской изучаемых микроструктур.

Благоприятные условия для фиксации создаются правильным выбором размера фиксируемого материала, ибо необходимо обеспечить равномерное и сравнительно быстрое проникновение фиксирующей жидкости во всю его толщину. Поэтому нужно вырезать кусочки толщиной не боле 5-10мм. Поперечный же и продольный размеры не имеют столь важного значения и определяются задачами исследования.

Взятие и фиксирование материала. Максимальные размеры кусочков составляют 1х1х0,5см; соотношение объема материала и фиксирующей жидкости должно быть не менее 1:9.

Вырезание кусочков для фиксации является одним из ответственных этапов в приготовлении качественных микропрепаратов. При выполнении этой операции необходимо знать основные особенности анатомо-гистологического строения органов, чтобы правильно выбрать место и направление разреза, а также величину вырезаемого кусочка. Так, если орган состоит из участков, различных по своему строению. Необходимо производить разрез таким образом, чтобы все они попали в кусочек, а при невозможности – брать кусочки отдельно из каждого участка.

Взятый из органа птицы образец ткани погружают в фиксатор – простой (70-96%-й спирт, 10-12%-й формалин, растворы уксусной кислоты, бихромата калия, осмиевой кислоты) или сложный (смеси простых фиксирующих жидкостей или солей тяжелых металлов в определенных пропорциях, обеспечивающие рН и молярность, близкие к таковым в организме). Действие фиксаторов проявляется в том, что в тканях и органах, в результате сложных биофизических процессов, происходит необратимая коагуляция белков, жизнедеятельность прекращается, то есть клеточные структуры становятся мертвыми. Они теперь находятся в том функциональном состоянии, в котором их застигла смерть, то есть фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема образца.

Уплотнение образцов ткани. Цель этого этапа – достичь высокой плотности и пластичности материала для того, чтобы приготовить из него тонкие срезы. Применяют уплотняющие среды – парафин, целлоидин, желатин, органические смолы или замораживание. Пропитка парафином продолжается 1-4 часа, целлоидином – до 1-3 недель. Кусочек ткани предварительно обезвоживают (проводят через спирты возрастающей концентрации: 60⁰, 70⁰,80⁰, 90⁰, 96⁰, 100⁰); затем спирт вытесняют промежуточной средой, способный смешиваться со спиртом и одновременно растворять уплотняющее вещество. При использовании парафина промежуточной средой служат циклические углеводороды (бензол, ксилол) или хлороформ. Для того, чтобы избежать перепада температур (парафин плавится при 60⁰С) после вытеснения спирта ксилолом, образец погружают 2-3 часа в смеси парафина с ксилолом при температуре 38⁰С. Из уплотненного парафином образца вырезают блоки, из которых и готовят тонкие срезы, способные пропускать свет, что является необходимым условием для световой микроскопии.

Приготовление срезов. Наиболее тонкие срезы, толщиной от 5 до 7 мкм, удается изготовить из материала, залитого в парафин. Из образцов, уплотненных целлоидином, готовят срезы толщиной 10-30 мкм. Срезы получают на санных или ротационных микротомах; для экспресс-диагностики (срезы толщиной 40-60 мкм) – на замораживающем микротоме.

Окрашивание срезов. Срезы окрашивают, чтобы увеличить контрастность различных гистологических структур в препаратах, предназначенных для исследования в световом микроскопе. Разработаны разнообразные методы окраски. В процессе окрашивания происходят сложные химические и физические процессы, поэтому при выборе метода учитывают избирательное сродство клетки к определенным красителям с разными физико-химическими свойствами.

Все красители подразделяются на кислые, основные и специальные. Структуры срезов, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными, основными красителями – базофильными; окрашивающиеся как теми, так и другими – нейтрофильными. Специальные красители селективно выявляют конкретные структуры, обладающие сродством к ним. Наиболее широко распространен комбинированный метод окраски тканей – гематоксилином и эозином. Гематоксилин (основной краситель) окрашивает ядра клеток в сине-фиолетовый цвет, а эозин (кислый) – элементы цитоплазмы в розово-желтый. Окрашенные препараты обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (50⁰, 70⁰, 96⁰, 100⁰), просветляют в ксилоле или некоторых маслах и затем каждый гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или синтетические смолы.

Импрегнация. Для выявления отдельных элементов ткани используются различные способы импрегнации. Так, для выявления ретикулиновых волокон используется хлорид золота. Для выявления элементов центральной и периферической нервной системы обычно применяют различные способы импрегнации (серебром, золотом, осмием). Окрашивать тела нервных клеток и их отростки можно и метиленовым синим. Все эти методы имеют тот существенный недостаток, что являются эмпирическими. Поэтому всегда надо быть готовым к тому, что даже при строгом соблюдении всех условий импрегнации она часто не дает желаемого результата. Здесь имеют значение многие факторы, которые иногда трудно учесть (качество фиксации, реакция и качество воды, свойство нервной ткани и т.д.)

Готовый (постоянный) гистологический препарат можно хранить годами и использовать для микроскопирования.

Методы микроскопии. Основным инструментом гистологического препарата служит микроскоп – световой или электронный.

Световая микроскопия. С помощью световых микроскопов можно изучить на срезах тонкое строение клеток и тканей. Размер наименьшей структуры, которую можно увидеть в световом микроскопе, определяется наименьшим разрешающим расстоянием (d_o). У современных световых микроскопов оно составляет около 0,2 мкм.

Устройство светового микроскопа (МБР – микроскоп биологический рабочий). Данный прибор состоит из оптической системы (объективов и окуляров), механических и осветительных частей. Все они объединяются между собой с помощью штатива. В последнем различают: поставку, тубусодержатель и тубус. Сверху в тубус вставлен окуляр, а снизу к нему присоединен объектив. Передвижение тубуса осуществляется двумя винтами, один их которых – кремальера, или макровинт, - служит для грубой наводки, а другой – микровинт – для микронаводки. Предметный столик служит для помещения изучаемого объекта, который фиксируется двумя зажимами-клеммами, крепящимися в отверстия предметного столика. Под предметным столиком расположены осветительные приспособления: осветитель (конденсор) и зеркало. С помощью зеркала через отверстие предметного столика направляется свет в объектив. Одна поверхность зеркала плоская, другая – вогнутая. При обычных лампах используют вогнутое зеркало, при специальных освещениях – плоское. Конденсор – закрепленная особым кольцом плоско-выпуклая линза, ее можно передвигать вниз и вверх. Служит он для концентрации световых лучей на объективе, он совершенно необходим при работе с сильно увеличивающими объективами. На конденсоре крепится диафрагма, позволяющая равномерно сужать и расширять отверстие для прохождения световых лучей и тем самым регулировать степень освещения объекта.

Ультрафиолетовая микроскопия – представляет собой разновидность световой. Длина волны ультрафиолетовых лучей составляет около 0,3 мкм; разрешающая способность микроскопа при иммерсионном объективе приблизительно 0,1 мкм.

Люминесцентная микроскопия основана на том, что многие органические вещества, содержащиеся в клетках, способны светиться (флуоресцировать) при поглощении ими световой энергии. Источником света в них служат ксеоновые или ртутные лампы (их спектр близок к ультрафиолетовому излучению и лежит в пределах коротких волн длиной 0,25-0,4 мкм), а объект исследуют через специальные фильтры.

Различают собственную, или первичную флуоресценцию, которой обладают пигменты (в том числе бактерии), витамины группы А и В₂ и другие вещества. Вторичную, или вызванную, флуоресценцию можно получить, используя специальные вещества – флуорохромы, которые связываются различными структурами живой клетки и вызывают их флуоресценцию. Например, при обработке срезов тканей флуорохромом акридиновым оранжевым ДНК и ее производные приобретают ярко-зеленое свечение, а РНК и ее производные – ярко-красное. Разновидностью вторичной является флуоресценция желто-зеленого цвета, индуцированная парами формальдегида и характерная для катехоламидов (адреналин и норадреналин) мозгового вещества надпочечников. Таким образом можно исследовать химический состав тканевых структур, выявлять трофические и секреторные включения в клетках.

Электронная микроскопия. В электронном микроскопе используются электронные лучи с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн при напряжении 50000-100000 вольт. Длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока или пучка электронов в условиях вакуума равна 0,0056 нм (1нм═1х10^-3мкм═1х10^-6мм ═1х10^-9м). Таким образом, разрешение достигает 0,002 нм или 0,000002 мкм, что в 100000 раз выше, чем в световом микроскопе. Методом электронной микроскопии исследуют ультратонкие срезы, толщиной от 500 до 1000 ангстрем, которые готовят на ультратомах – сложных электронных приборах, где ножами служат очень острые грани зеркального стекла. Тончайшие срезы наносят на специальные металлические сетки с ячейками и помещают в вакуумную камеру электронного микроскопа. Обработка образцов тканей для ЭМ сходна с ранее описанной обработкой для световой микроскопии. Только здесь в качестве фиксаторов используют забуференные растворы параформа, тетроксида осмия, глютаральдегида (рН 7,0-7,4); образцы проводят через спирты восходящей концентрации и пропилен-оксид и заливают в синтетические смолы (аралдит, эпон или в их смесь). Чтобы более четко выявить органеллы мембранного и немембранного типа, в качестве контрастера применяют цитрат свинца и уранилацетат.

К современным электронно-микроскопическим методам относят ПЭМ (просвечивающую, или трансмиссионную электронную микроскопию), СЭМ (сканирующую), электронную авторадиографию, иммунно-электронную микроскопию, ЭМ гистохимию.

Сканирующий ЭМ от трансмиссионного отличается тем, что в первом электроны не проходят через объект, а отражаются от его поверхности, сканируя ее. В отличие от ПЭМ для СЭМ можно использовать коррозийные препараты: объект изучения, например микроциркуляторное русло лимфатических сосудов, заливают какими-либо затвердевающими веществами и после этого просматривают слепки и его поверхности. Изучают также реплики, получаемые путем замораживания – скалывания. В этом случае исследуют слепок скола поверхности объекта. Чтобы увеличить контрастность, реплики необходимо оттенить с помощью напыления частиц металлов (золота, платины) или угля.

Цитохимические и гистохимические методы исследования. Качественные гистохимические методы основаны на использовании реакций, с помощью которых выявляют химические вещества в клетках тканей и органов. Зная, как распределяются в тканях белки, жиры, углеводы, ферменты и другие вещества в норме и при различных воздействиях на организм, можно судить с большей или меньшей вероятностью о направленности метаболических процессов в исследуемых структурах. Современными гистохимическими методами обнаруживают в клетках аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, витамины, минеральные и другие вещества, определяют активность различных ферментов, например в цикле Кребса. Выявление этих веществ основано на специфичности реакций между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и на выделении продуктов химических реакций в виде окрашенных осадков. Чтобы повысить специфичность реакций, часто применяют метод ферментативного контроля. Например, для выявления ДНК и РНК используют галлоцианин – хромовые квасцы, окрашивающие нуклеиновые кислоты в стойкий сине-фиолетовый цвет. РНК и ДНК обнаруживают с помощью реакции Фельгена и Эйнарсона. В основе гистохимии веществ, содержащих полисахаридный компонент, лежит реакция шифф-йодная кислота (ШИК – реакция). С помощью этой реакции можно выявить гликогены, мукопротеиды, гликопротеиды и гликолипиды.

С помощью количественных гистохимических методов изучают химический состав конкретных структур клетки.

Цитоспектрофотометрия – это метод количественного и качественного изучения веществ по спектру их поглощения в структурах отдельных клеток. С его помощью можно установить суммарное содержание белков или других элементов. В основе метода лежит принцип абсорбции спектрофотометрии. Например, с помощью интерферометрии можно оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетке.

Метод дифференциального центрифугирования основан на применении центрифуг, развивающих скорость от 20000 до 150000 мин^-1 и более. При центрифугировании в определенных условиях, например, в сахарозе в зависимости от градиента плотности, удается отделить и осадить различные органеллы клеток: ядро, митохондрии, фракции пиноцитозных и синаптических пузырьков, рибосом и других компонентов, пригодных для гистохимического исследования.

Метод радиоавтографии широко применяется для изучения кинетики клеточных популяций, метаболических процессов в клетках, и определения участков синтеза биополимеров с помощью регистрации веществ, меченых изотопами. Для этого в ткань животного или среду с культивируемыми клетками вводят предшественников какого-либо макромолекулярного соединения (например, аминокислоты, нуклеотиды), один их атомов которого замещен радиоактивным изотопом (например, радиоактивного водорода Н³, углерода – С¹⁴, серы, фосфора и других). В процессе синтеза белков, гормонов, ферментов и иных веществ в них включается молекула меченого предшественника. Для регистрации места ее включения в темноте на окрашенные обычными методами срезы наносят специальную мелкозернистую фотоэмульсию, после чего срезы проявляют. На участках соприкосновения фотоэмульсии с радиоактивным веществом происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки – метки, или треки. Этим методом можно, например, определить время перемещения клеток, меченных Н³–тимидином в пластах многослойного эпителия, синтез йодсодержащих гормонов в щитовидной железе. С помощью меченого лейцина, радиоактивных предшественников адреналина, норадреналина и серотонина можно определить не только скорость аксонального транспорта от нейронов к клеткам-мишеням, но и установить топографию нервных связей.

Современная гистология располагает многочисленными и разнообразными методами, с помощью которых можно всесторонне изучать строение и функцию живых клеток и тканей органов.

Фазовоконтрастная микроскопия. Естественные биологические объекты в силу наличия в них жидкостей, прозрачны, бесцветны и неконтрастны. Их структуры по отношению к проходящему свету характеризуются одинаковой поглощающей способностью. В отличие от обычной световой микроскопии, где клеточные структуры контрастируют с помощью окрашивания препарата, в фазовоконтрастном микроскопе системы Наварского, контрастирование достигается благодаря использованию специальных объектива и конденсора. Последний преобразует фазовые изменения проходящего через объект света в изменение освещенности полученного изображения. Световые волны могут интерферировать, увеличивая или уменьшая амплитуду результирующих волн. Таким образом, разные компоненты клеток становятся различимыми под микроскопом. В фазовоконтрастном микроскопе различия в амплитуде достигаются благодаря использованию двух пучков световых волн: один падает на объект, другой дифрагирует от него. Данный метод используют, в частности, для прижизненного изучения пленочных препаратов, а также культур клеток и тканей.

Методы изучения анатомии.

1. Обычное и тонкое препарирование мышц, сосудов, нервов птиц с использованием различных режущих и фиксирующих инструментов (скальпеля и пинцета).

2. Фиксация. Для того, чтобы сохранить тушки птиц от процессов гниения используют фиксирующие вещества как формалин, спирт и другие фиксаторы.

3. Вскрытие трупа для изучения топографии органов.

4. Метод изготовления коррозийных препаратов основан на введении быстро застывающих веществ в сосуды или проводящих путей органов (например, мочевые пути лоханки почки, бронхи легкого и др.), дальнейшей мацерации мягких тканей налитых органов.

5. Мацерация мягких тканей органов заключается в получении скелета птицы

6. Наливка кровеносных сосудов красящими веществами, например, гуашью.

7. Метод авторадиографии – исследование отдельных органов путем введения в них радиоактивных веществ.

8. Рентгенологический метод – исследование отдельных органов живого организма путем использования рентгеновских лучей.

Цитология – наука о строении, жизнедеятельности и общих закономерностях развития клеток. В целом цитология – наука, довольно молодая. Из среды других биологических наук она выделилась почти сто лет назад. В первой половине XYII века делались попытки изучения структур, невидимых простым глазом, с помощью увеличительных стекол (лупы). В 1625 г. Стеллутти впервые использовал линзы для исследования анатомических объектов. В середине XYII века английский физик Роберт Гук (1635-1703гг), благодаря усовершенствованному микроскопу (увеличительных линз), увидел пустоты в пробке и впервые применил к ним термин «клетка» – cellula (лат.), kytos (греч.). («Микрография или некоторые физиологические описания мельчайших телец при помощи увеличительных стекол», 1965). Большой вклад в развитие микроскопа внес голландский оптик Антони ван Левенгук, который в 1667 году разработал микроскоп, способный увеличивать изображение в 300 раз. Им были описаны красные кровяные тельца и их движение в капиллярах, спермии, поперечнополосатые мышцы, нервы, сухожилия, также первые простейшие организма, обнаруженные в капле воды. Несколько позже открытия Р. Гука итальянский анатом М.Мальпиги (1671-1675гг) изучил строение кожи, селезенки, почки и др. Английский натуралист Неэмия Грю (1641-1712гг) при описании растений («Анатомия растений», 1682) установил понятие «ткань» как структуру. Активное становление гистологии начинается с 30-х годов XYIII столетия. Прогресс в изучении микроанатомии и клетки связан с развитием микроскопирования в XIX в. Среди ученых успешно продолжающих микроскопические исследования клеток, или «комочков», различных тканей животных был и Ян Евангелиста. Изучая яйцо курицы, он впервые описал (1825-1827гг), главный органоид клетки – ядро, а также нейроны головного мозга, которые затем были названы его именем – клетки Пуркинье. Изменились представления о строении клеток: главным в организации клетки стала считаться не клеточная стенка, а собственно ее содержимое, протоплазма (Пуркинье, 1830). В протоплазме был открыт постоянный компонент клетки – ядро (Браун, 1838). Все эти многочисленные наблюдения позволили подойти к обобщениям, которые впервые были сделаны Т.Шванном в 1838г. Он показал, что клетки растений и животных принципиально сходны между собой (гомологичны). «Заслуга Т. Шванна заключалась не в том, что он открыл клетки как таковые, а в том, что он научил исследователей понимать их значение» (Вальдейер, 1909). Дальнейшее развитие и обобщение эти представления получили в работах Р.Вирхова (1958). Впервые обобщенные сведения о строении клеток были собраны в книгу Ж.Б. Карнуа «Биология клетки», вышедшей в 1884г.

Создание клеточной теории стало важнейшим событием в биологии, одним из решающих доказательств единства всей живой природы и имеет огромное общебиологическое значение, так как оказала значительное влияние на развитие биологии, послужила главным фундаментом для развития таких дисциплин, как эмбриология, гистология и физиология. Она дала основы материалистического понимания жизни, для объяснения эволюционной взаимосвязи организмов, для понимания индивидуального развития.

В 1838г Шванн (Schwann) и Шлейден (Schleiden, 1839) независимо один от другого сформулировали клеточную теорию. Основные положения клеточной теории сохранили свое значение на сегодняшний день, хотя более чем за сто лет были получены новые данные о структуре, жизнедеятельности и развитии клеток. В настоящее время клеточная теория постулирует: 1 – клетка – элементарная единица живого (данное представление было сформулировано Т.Шванном и развито в трудах Р.Вирхова); 2 – клетки разных организмов гомологичны по своему строению (клетки всех организмов, несмотря на их разнообразие, имеют общий принцип строения: они имеют ядро, цитоплазму, основные органеллы) – так же сформулировано Т.Шванном; 3 – размножение клеток происходит путем деления исходной клетки; 4 – многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток, объединенные в целостные, интегрированные системы тканей и органов, подчиненных и связанных между собой межклеточными, гуморальными и нервными формами регуляции.

В организме животного организма кроме клеток имеются неклеточные структуры – симпласты и синцитий, возникшие либо в результате слияния клеток, либо в результате деления ядер без последующей цитотомии. Симпласты (греч. sym – вместе; plastos - строение)– это многоядерные структуры, состоящие из большого объема цитоплазмы, включающей много ядер. Примером симпласта является поперечно-полосатое мышечное волокно. Синцитий (syn – вместе; kytos – клетка), (соклетия) – клетки, связанные ципоплазматическими перемычками. Примером синцития служат сперматогонии.

Клетка – cellula (лат.), kytos (греч.) – элементарная частица всего живого. В организме всех животных, в частности, у птиц имеются два вида клеток – соматические (soma - тело) и половые. Из соматических (телесных) клеток построены тело животного, его внутренние органы, половые клетки – участвуют в размножении животного организма.

Клетки являются основным структурным и функциональным элементом организма. Их форма, размеры и специфичность дифференцировки разнообразны, характерны для различных тканей и в значительной степени отражают своеобразие их организации в связи со специфичностью их функций. Так, клетки крови, взвешенные в ее плазме, округлые. Клетки, выстилающие поверхности, плотно прилежат друг к другу и имеют плоскую, кубическую или призматическую форму. Клетки гладкой мышечной ткани вытянутые, веретенообразные. У нервных клеток длинные отростки, что позволяет им проводить импульсы на большие расстояния.

Вещества клетки – протоплазма – в процессе жизнедеятельности непрерывно взаимодействует с окружающей средой. Химический состав ее определяется специфичностью обмена веществ организма. Известно, что 96% массы животного составляют 4 элемента: углерод, кислород, водород и азот. В значительных количествах (в сумме до 3%) в тканях содержатся калий, кальций, натрий, фосфор, сера, магний, железо, хлор. Все остальные химические элементы, входящие в состав тканей организма, - микроэлементы (медь, марганец, кобальт, цинк и др.) – содержатся в сотых и тысячных долях процента, участвуют в важнейших физиологических процессах, имеют существенное значение в жизнедеятельности организма.

В результате изучения клеток под микроскопом было установлено, что они состоят из трех частей: ядра – наследственного аппарата, цитоплазмы – метаболического аппарата и активной плазматической мембраны – основы поверхностного аппарата клетки.

В живых клетках более или менее в центре расположено тельце, которое по своему показателю преломления отличается от остальной клетки. Это тельце получило название ядра, потому что первым исследователям оно напоминало ядро ореха, заключенное в скорлупу. По этой же причине слова, относящиеся к ядру, часто начинаются, с префикса кари (от греч. karion – орех). Так, например, разрушение ядра, сопровождающее гибель клетки, называют кариолизис (от греч. lizis – растворение).

Ядро клетки обеспечивает хранение и передачу наследственной информации в ряду клеточных поколений, служит центром управления метаболизма в клетке, включая синтез белков. Если удалить ядро, клетка погибает.

Ядра клеток могут иметь разную форму: округлую, овальную, палочковидную, подковообразную, кольцевидную. Они могут быть сегментированными или лопастными. Кариоплазма представляет собой комплекс гидрофильных коллоидов более вязкой консистенции, чем цитоплазма. В зависимости от физиологического состояния клетки, фазы жизненного цикла структура ядра может видоизменяться и соответственно чему делится на делящееся ядро (состояние митоза), выполняющее функцию передачи наследственной информации от клетки к клетке; ядро, синтезирующее наследственный материал (редупликация, или удвоение, ДНК в период S-период); интерфазное ядро (в промежутках между делениями), управляющее жизнедеятельностью клетки в выборе гормонов, секреторных гранул, нейромедиаторов, белков.

На окрашенных препаратах можно видеть, что ядро одето ядерной мембраной, или оболочкой (кариолемма). В ядре имеются одно или несколько округленных темноокрашенных телец, называемых ядрышками, хроматин и кариоплазма.

Ядерная оболочка (кариолемма). Она состоит из наружной и внутренней липопротеидных мембран, разделенных перинуклеарным пространством, и пронизана порами. Количество пор в ядерной оболочке тесно связано с функциональным состоянием наследственного аппарата клетки и периодом жизнедеятельности последней. Чем интенсивнее процессы синтеза в ядре, тем больше пор в ядерной оболочке. Ядерная оболочка не допускает проникновения в ядро одних веществ и выхода из него других. Считают, что в цитоплазму из ядра поступают высокомолекулярные соединения и информационная РНК (иРНК), а из цитоплазмы в ядро – структурные белки, ферменты, биологически активные вещества и другие соединения. Ядерная оболочка может образовывать временные динамичные связи с пластинчатым комплексом (аппаратом Гольджи).

Хроматин. Это компонент интерфазного ядра эукариотических клеток, обнаруживаемый в виде глыбок и зерен, окрашивающихся основными красителями, из-за чего и получил свое название chroma – краска. Термин «хроматин» предложил немецкий биолог Вальтер Флемминг (Walter Flemming, 1880). Хроматин представляет собой сложный комплекс дезоксинуклеопротеидов (ДНП), состоящий из ДНК (40% общей массы), белков-гистонов (60%, 85% гистонов и 15% кислых белков) и частично РНК (до 1%). Основываясь на сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), электронной авторадиографии и электронной цитохимии, можно утверждать, что хроматин – это в большей части деспирализованные хромасомы. Хроматин, который виден под световым микроскопом, называют конденсированным, тогда как те части хромосомной нити, которые видны под электронным микроскопом, называются деконденсированным. В передаче информации, направляющей синтез белка в неделящейся клетке, участвует только ДНК деспирализованного или деконденсированного хроматина. Иначе говоря, весь хроматин, который можно увидеть под световым микроскопом в ядрах функционирующих клеток тела, по всей вероятности, не выполняет никаких функций. Соответственно деконденсированный хроматин получил название эухроматина, т.е. «хорошего» хроматина, поскольку он «работает», а конденсированный хроматин назвали гетерохроматином (от греч. гетеро – другой), т.е. хроматином другого рода. На петлях деспирализованной ДНК синтезируется РНК.

Из хроматина построены хромосомы. Однако хромосомы как палочковидные или нитевидные структуры видны только в определенные фазы деления клеток.

Ядрышко – производное хромосом, характеризующееся высокой концентрацией РНК и ее активным синтезом в интерфазе. Ядрышко формируется на специализированных участках хромосом – в ядрышковых организаторах. В ядре может быть несколько ядрышек, хорошо окрашивающихся основными красителями. В ядрышках выявлены два компонента: фибриллярный, представляющий собой рибонуклеопротеидные тяжи предшественников рибосом и гранулярный – формирующиеся субъединицы рибосом. Ограничивающей мембраны у ядрышка нет. Функция ядрышка – образование рибосомальной РНК (рРНК).

Кариоплазма состоит из свободных нуклеопротеидов, нуклеотидов, ферментов (в частности ДНК- и РНК-полимераз), специфических белков – гистонов, характерных только для ядра и участвующих в образовании оболочки хромосом.

Интерхроматиновый ядерный матрикс представлен фибриллами и гранулами рибонуклеопротеидов (РНП), тесно характеризующими на периферии с субмембранной пластинкой ядра. Матрикс обеспечивает прикрепление ДНК и РНК к филаментам и регулирует их редупликацию и транскрипцию.

Хромосома делящейся клетки состоит из двух хроматид, соединенных между собой перетяжкой. Последняя представляет собой неспирализованный участок ДНК – центромеру, или кинетохор. Снаружи хромосомы покрыты белковой оболочкой из гистонов. Хромосомы бывают различной формы: равноплечие, неравноплечие, в виде барабанной палочки; состоят из ДНК (90%), РНК (10%) и некоторого количества Cu, Mg. Ряд авторов считают, что ионы Cu и Mg участвует в склеивании молекул ДНК в хромосоме. В клетках курицы 78 хромосом. У всех соматических клеток набор хромосом диплоидный, или двойной, образующийся в результате слияния двух половых гаплоидных клеток – самцов (ZZ) и самок (WZ). Функция хромосом заключается в синтезе специфических для данного организма нуклеиновых кислот, из которых ДНК отвечает за хранение и передачу наследственной информации в клеточных поколениях, а РНК управляет синтезом белков в клетке.

Модель структуры ДНК был предложен американскими учеными Дж. Уотсон и Ф. Крик (1956). Молекула ДНК представляет собой две спаренные антипараллельные цепи, закрученные одна вокруг другой в правую спираль. Каждая цепочка ДНК в свою очередь является полимером, образованным из нуклеотидов. В состав нуклеотида входят три элемента: два постоянных (фосфорная кислота и сахар дезоксирибоза) и один переменный, который может быть представлен одним из четырех азотистых оснований: аденином (А), тимином (Т), гуанином (Г) и цитозином (Ц). Благодаря различному чередованию последовательностей нуклеотидов в цепочке достигается большое разнообразие синтезируемых белков. Две цепи ДНК соединены в одну молекулу азотистыми основаниями через водородные связи. При этом А соединяется только с Т (двумя водородными связями), а Г – только с Ц (тремя связями). Строгое соответствие нуклеотидов друг другу в двойной спирали ДНК получило название комплементарности. По этому принципу образуются новые молекулы ДНК на базе исходной (матричной) молекулы.

Редупликация ДНК. Удвоение, или редупликация, ДНК сводится к тому, что исходная двойная спираль молекулы под действием фермента ДНК-полимеразы распадается вдоль водородных связей на две цепочки. К азотистым основаниям каждой цепочки по принципу комплементарности присоединяются свободные нуклеотиды, присутствующие в большом количестве в нуклеоплазме. В результате этого процесса вместо одной двухцепочечной молекулы ДНК образуются две двухцепочечные дочерние молекулы, а количество ДНК увеличивается в два раза (было 2с, стало 4с). Таким образом, функция ДНК заключается не только в хранении, но и в воспроизведении и передаче в процессе деления клетки наследственной информации из поколения в поколение. При этом клетки – половые (в случае полового размножения) и соматические (при бесполом) – несут в себе только задатки, возможности организмов и их свойств.

Ген – это участок молекулы ДНК, кодирующий информацию об определенном белке. Используют другой термин – цистрон – отрезок ДНК, несущий информацию, необходимую для синтеза одной полипептидной цепи (один цистрон – один полипептид). Полипептиды – это предшественники белков, состоящие из различного количества аминокислот, последовательно связанных пептидными связями. Таким образом, ДНК кодирует синтез белковых молекул, то есть последовательность нуклеотидов ДНК должна определять аминокислотную последовательность в белках. Система «записи» наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот в виде последовательных азотистых оснований называется генетическим кодом. Примечательностью генетического кода является то, что он универсален: белковые молекулы всех животных организмов построены из 20 аминокислот, а в состав нуклеиновых кислот входит пять азотистых оснований (А,Г,Т,Ц,У).

У всех организмов одного и того же вида определенный ген располагается на одном и том же участке (в одном локусе) определенной хромосомы. Соматические диплоидные клетки содержат гомологичные хромосомы, полученные от отца и матери. Два гена, расположенные в одних и тех же локусах гомологичных хромосом и определяющие развитие признаков, называются аллельными. Изменчивость признаков в пределах одного и того же вида обусловлена изменением генетической информации при неблагоприятном воздействии условий внутренней, или внешней среды. Наследственность и изменчивость – два фактора, на основе которых можно охарактеризовать такие генетические понятия как генотип и фенотип.

Генотип – это совокупность всех генов организма, то есть той наследственной информации, которая была получена организмом от предыдущих поколений. Фенотип – это совокупность всех развивающихся признаков и свойств организма в конкретных условиях его онтогенеза (индивидуального развития). Фенотип формируется на основе генотипа под воздействием определенных факторов внутренней и внешней среды.

Цитоплазма клетки состоит из гиалоплазмы и обязательных клеточных компонентов: органелл – мембранных, немембранных, а также специального назначения (в специализированных клетках) и различных видов непостоянных структур – включений.

Гиалоплазма (hyaloplasma) – это коллоидная система, включающая в себя различные биополимеры: белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, ферменты, а также нерастворимые и растворимые соли, образующие взвеси и суспензии. В ней могут находиться запасные питательные вещества в виде липидных капель, гранул гликогена, пигменты. Морфобиохимическая структура и функция гиалоплазмы вблизи разных органелл неодинаковы.

Билогические мембраны, несмотря на разнообразие строения, представляют собой пласты липопротеидной природы (липиды – 40%, белки – 60%). В их состав входят различные субстанции и энзимы, катализирующие многочисленные специфические, характерные для клеток химические реакции, протекающие на границе двух фаз: между структурами цитоплазмы – органеллами и цитоплазматическим матриксом, между клетками и окружающей средой. Мембраны регулируют взаимодействие ферментов и субстратов во времени. Молекулы липидов характеризуются наличием несущих заряд полярных головок – гидрофильного полюса молекулы и неполярных хвостов (их гидрофобного полюса), образованных жирными кислотами. Внутренняя сторона мембраны по отношению к наружной заряжена более отрицательно. Взаимодействие последних формирует жидкостно-бимолекулярный слой липидов биологических мембран. Белки в составе мембраны связываются с липидами как с помощью ионных, так и на основе гидрофобных связей, погружаясь в липидный слой мембраны. Мембранные белки представлены тремя разновидностями: периферическими, интегральными и полуинтегральными.

Периферические белки располагаются на поверхности мембраны. Их молекулы связаны с полярными головками молекул липидов электростатическим взаимодействием. Интегральные и полуинтегральные белки погружены в липидный слой. Белки обеспечивают такие функции клетки как рецепцию, регулируемый транспорт, структурную организацию процессов метаболизма и др.

Белки мембран, взаимодействуя с молекулами липидов, не закреплены жестко и способны менять степень, погружения в липидный слой и перемещаться в плоскости мембраны.

Мембранные органеллы. К мембранным органеллам относят эндоплазматическую сеть, аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии, транспортные вакуоли. Биологическая мембрана – это наиболее распространенный компонент структурной организации клетки. Все мембраны представляют собой тонкие (6-10нм) липопротеидные слои. Соотношение их основных компонентов: липиды – около 40%, белки 60 и углеводов 5-10%. Мембрана выглядит следующим образом: в билипидный слой вкраплены белковые молекулы. Различают три типа белков: поверхностные – примыкающие к липидному слою; интегральные – принизывающие его насквозь; внутренние, или подмембранные. Билипидный слой, лежащий в основе мембраны, представлен молекулами фосфолипидов (фосроглицериды, фосфадилхолин, фосфатидэтаноламин, фосфатилинозит и фосфатилсерии). Особенность фосфолипидной молекулы – полярная гидрофильная головка, образованная спиртами, и два гидрофобных «хвоста» – углеродные цепи – остатки жирных кислот, связанные со спиртом глицерином. В мембране встречаются также в небольшом количестве гликолипиды – соединение липидов и сахара. Среди них выделяют класс ганглиозидов. Важный компонент мембран животных клеток – стероидный липид холестерол, определяющий жидкостность мембраны.

Эндоплазматическая сеть (ЭПС). Существуют две разновидности ЭПС – гранулярная, или ГрЭПС и гладкая, или ГлЭПС, связанные структурно и функционально. В ГрЭПС мембраны формируют уплощенные цистерны, на поверхности которых располагаются многочисленные рибосомы. Мембраны ГлЭПС образуют сетевидную систему трубочек, каналов и пузырьков небольшого диаметра.

Несмотря на структурную связь гранулярной и гладкой эндоплазматических сетей их функциональное значение различно.

ГрЭПС с прикрепленными к ней рибосомами обеспечивает синтез и транспорт предшественников белков (секреторных, транспортных, рецепторных, строительных, ферментных, сократительных и других). Кроме того, в ней к белковым молекулам присоединяются углеводные, фосфорные или липидные остатки и т.д. Часть ГрЭПС находится в прямом контакте с ядерной мембраной.

В ГлЭПС с помощью встроенных в мембраны ферментов (в частности оксидаз) осуществляется детоксикация веществ. ГлЭПС способна накапливать и транспортировать ионы, служить резервуаром для питательных веществ; на ее мембранах протекает синтез липидов, а также гидролитическое расщепление гликогена. В ГлЭПС коры надпочечников синтезируются предшественники стероидных гормонов.

Аппарат Гольджи (АГ). Аппарат Гольджи представлен стопками уплощенных цистерн, вакуолями, или секреторными пузырьками, различного диаметра и транспортными пузырьками.

АГ локализуется между ГрЭПС и плазматической мембраной. В его периферической зоне расположены полирибосомы, участвующие в выработке специфических ферментов для мембран АГ. Цистерны в виде изогнутых дисков образуют стопки из 3-30 элементов, разделенных пространством, шириной 15-30нм. Выпуклая поверхность стопок, или цис-поверхность (незрелая), обращена к ядру, а вогнутая, или транс-поверхность (зрелая) – к плазмолемме. Поверхности АГ различаются не только в структурном плане, но также по ферментативной активности и составу ферментов. Периферические отделы цистерн расширены: от цистерн цис-поверхности отделяются (отшнуровываются) пузырьки, а от цистерн транс-поверхности – вакуоли. Содержимое пузырьков и вакуолей (секреторный продукт) умеренной плотности. Синтезированные на рибосомах и полирибосомах белки поступают по каналам ГрЭПС в стопку цистерн АГ из транспортных пузырьков с цис-поверхности. Внутри цистерн белковые продукты накапливаются, конденсируются в гранулы и выходят в вакуолях с транс-поверхности. В АГ синтезируются полисахариды и гликопротеиды, конденсируется секреторный продукт, образуются и упаковываются секреторные гранулы, а также сортируются белки на транс-поверхности. Белки из АГ транспортируются в виде трех основных потоков: в гидролазные пузырьки (первичные лизосомы); в пламолемму – в виде пузырьков и в секреторные гранулы – в виде пузырьков, утрачивающих позднее оболочку.

Лизосомы. Это мелкие округлой или сферической формы пузырьки, окруженные одинарной мембраной толщиной 10 нм и содержащие набор гидролитических ферментов (протеаз, липаз, нуклеаз, фосфатаз и др.), способных разрушать практически все природные полимерные органические соединения. Лизосомы участвуют в процессе пищеварения (внутриклеточное переваривание) клетки.

Среди лизосом выделяют первичные и вторичные лизосомы, аутофагосомы и остаточные тельца. Первичные лизосомы, формирующиеся в АГ, содержат кислую фосфатазу и большое количество гидролаз. Они подходят к пищеварительной вакуоли и сливаются с ней. Образуя вторичную лизосому. Гидролазы активизируются, вступают во взаимодействие и начинают расщеплять сложные органические питательные вещества до мономеров, а затем и до конечных продуктов метаболизма, которые поступают в гиалоплазму. Вторичная лизосома может вступить в контакт с другой фагосомой и обеспечить расщепление содержащихся в них частиц. Такие циклы могут повторяться многократно, при этом остатки непереваренной пищи накапливается во вторичных лизосомах. Последние превращаются в остаточные тельца (телолизосомы), внутри которых часто выделяются миелиноподобные слоистые структуры фосфолипидной природы, а также скопления пигмента и кристаллы нерастворимых солей. Остаточные тельца могут находиться в клетке длительное время или они удаляются путем экзоцитоза.

Лизосомы участвуют и в аутофагии – самопереваривании отдельных органелл и участков цитоплазмы клетки, необратимо изменившихся в результате старения или использующихся для поддержания жизнедеятельности клетки в экстремальных условиях. Процессы аутофагии можно рассматривать как способность организма поддерживать эндогенное питание в условиях голодания. Разновидностью аутофагии служит кринофагия – регуляция лизосомами поступления в кровь секрета, например, из щитовидной железы или аденогипофиза.

Митохондрии – подвижные тельца различных размеров и формы, ограниченные двуслойной мембраной. Количество митохондрий в клетках различных тканей варьирует от 500 до 1000 и более. Митохондрии проявляют пластичность своей структуры: они могут быть округлыми, палочковидными, гантелевидными, нитевидными, разветвленными, сливаться, образуя гигантскую структуру, которая затем может распадаться на множество мелких митохондрий. Митохондрии способны быстро делиться (менее чем за 1 минуту). Двойная мембрана органеллы состоит из наружного и более толстого внутреннего слоя, разделенных межмембранным пространством. Слои различаются не только по структуре, но и по содержанию белков (менее 20% в наружном и 75% во внутреннем) и составу липидов. Наружный слой беднее ферментами, тогда как внутренний и митохондриальный матрикс насыщены ими.

Внутренняя мембрана образует выросты в виде кладок – кристы, впячивающиеся в митохондриальный матрикс. В зависимости от типа клеток кристы могут иметь вид пластинок (складок), продольных или поперечных трубочек и везикулярных структур; располагаться параллельно длинной оси митохондрии (в аксонах нейронов, волокнах скелетных мыщц) или перпендикулярно ей (клетки печени, почек). Структура крист лабильна – они могут трансформироваться (менять форму), редуцироваться и восстанавливаться в зависимости от функционального состояния ткани.

Митохондрии участвуют в синтезе АТФ (аденозитрифосфорной кислоты) – макроэргического соединения, при гидролизе которого высвобождается энергия. В митохондриях происходит аэробное окисление органических соединений (клеточное дыхание) и освободившаяся энергия используется вновь для синтеза молекул АТФ. В указанных реакциях участвует ряд ферментов так называемого цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса), которые локализованы в матриксе митохондрий. На мембранах крист затем происходит окислительное фосфорилирование при участии расположенных здесь белков цепи окисления и ферментов фосфорилирования АДФ (аденозиндифосфорной кислоты), поэтому митохондрии и называют энергетическими станциями клетки, или органеллами клеточного дыхания.

Немембранные органеллы – это рибосомы, центросома, микротрубочки, микрофибриллы.

Рибосомы как маленькие плотные тельца были впервые описаны Палладе в 1955 г., а в 1958г. Робертс дал им название «рибосома». Их можно увидеть только в электронный микроскоп.

Это округлые образования диаметром 10-30 нм, состоящие из двух ассиметричных субъединиц. Обе субъединицы образованы РНК и белками примерно в равных количествах, которые связаны в виде рибонуклеопротеидов (РНП). Большая субъединица катализирует сборку пептидных цепей, малая – связывает иРНК. Субъединицы образованы рибосомальными РНК (рРНК), синтезирующимися в ядрышке и особыми белками, которые связываются с рРНК в ядре. В дальнейшем субъединицы по отдельности через ядерные поры поступают из ядра в цитоплазму, где и участвуют в синтезе белка. Рибосомы могут встречаться в виде свободных единичных органелл, образовывать комплексы (от 3 до 30 рибосом) – полисомы (последние характерны для недифференцированных камбиальных клеток), или быть фиксированными на мембранах эндоплазматической сети. Функционально неактивные рибосомы постоянно обмениваются своими субъединицами. Сборка рибосом происходит в начале синтеза белка, а по завершении синтеза они диссоциируют.

Центросома (клеточный центр) – органелла, присущая животным клеткам. В клетках растений ее нет. Обнаружена и описана практически одновременно Флемингом в 1875 г. и Бенсденом в 1876г.

Центросома состоит из центриолей и центросферы. В состав центросомы обычно входят две центриоли (диплосома), перпендикулярно расположенные друг к другу. Каждая из них состоит из девяти триплетов (троек) микротрубочек, уложенных с помощью специальных образований в виде цилиндра шириной 0,15 мкм и длиной 0,3-0,5 мкм. Микротрубочки центриолей такого же строения, как и микротрубочки цитоплазмы, и отличаются от них лишь большой стабильностью. Одна из центриолей материнская, другая – дочерняя. На материнской центриоли имеется ряд дополнительных структур: сателлиты, придатка и др., которых нет на дочерней центриоли. Центросфера – зона цитоплазмы с расходящимися нитчатыми структурами в виде лучей, окружающая центриоли. Электронная микроскопия показала, что лучистое ее сияние – это многочисленные микротрубочки, отходящие от сателлитов и радиально расходящиеся вокруг центриолей. В реснитчатых клетках центриолей гораздо больше, так как в основании каждой реснички расположена центриоль в виде базального тельца.

Центриоли – самовоспроизводящиеся структуры. Центриоли являются центрами сборки микротрубочек цитоплазмы, микротрубочек веретена деления, выполняют роль базальных телец, от которых отрастают реснички и жгутики, индуцируют полимеризацию белка тубулина.

Микротрубочки представляют собой полые неветвящиеся цилиндры диаметром 20-25 нм, состоящие из мономеров белка тубулина. Микротрубочки участвуют в поддержании формы клетки, определяют ее полярность, разграничивают функционально отличающиеся друг от друга участки цитоплазмы, входят в состав клеточного центра, ресничек, а также веретена деления при митозе и мейозе.

Микрофибриллы и микрофиламенты – нитчатые структуры различной длины, но самые короткие и самые тонкие, толщиной от 5 до 10 нм, образованные белками (актин). Располагаются по всей цитоплазме, но особенно развиты у апикального полюса клетки, где образуют терминальную сеть. Встречаются в конусах роста, микроворсинках и на других участках клетки, находящихся в состоянии локомоторной активности, выполняют опорную и двигательную функции, в различных тканях образуя специальные органеллы.

Специальные органеллы – постоянные структуры, присущие клеткам определенных тканей. К ним относятся реснички, жгутики, тонофибриллы, нейрофибриллы, микроворсинки.

Реснички и жгутики – органеллы движения. Реснички развиты в клетках эпителия дыхательных путей и некоторых отделов половых трактов, а жгутики имеются у спермиев. Структура ресничек и жгутиков сходна, отличаются они лишь размерами. Реснички имеют длину 5-10 мкм, жгутики – 150 мкм. И те и другие представляют собой длинные тонкие выросты цитоплазмы, покрытые цитолеммой, имеющие в основании базальное тельце, а по всей длине – аксонему. Базальное тельце представляет собой центриоль, у которой можно наблюдать дополнительные структуры, характерные для материнской центриоли, а иногда можно видеть и дочернюю центриоль, расположенную под прямым углом к материнской. Основная нить ресничек и жгутиков – аксонема организована подобно центриоли, но содержит девять дублетов (пар) периферических и две центральные микротрубочки. Периферические и центральные микротрубочки связаны между собой в единую подвижную систему. При движении ресничек и жгутиков происходит скольжение микротрубочек друг по другу, в результате чего органеллы изгибаются.

Тонофибриллы, миофибриллы, нейрофибриллы – разновидности микрофибрилл и микрофиламентов, характерные для той или иной ткани. Тонофибриллы развиты в эпителиальных тканях, где образуют скелет клеток. Миофибриллы развиты в мышечных тканях, и определяют сократимость мышечных клеток и волокон, а нейрофибриллы – в нервных клетках. Предполагается, что они участвуют в токе аксоплазмы и проведении нервного импульса.

Микроворсинки – выросты цитоплазмы, одетые цитолеммой и содержащие внутри пучок микрофиламентов. Они увеличивают всасывательную поверхность клетки. Особенно хорошо развиты в кишечном эпителии.

Включения. Это необязательные компоненты клетки, появляющиеся и исчезающие в зависимости от интенсивности и характера обмена веществ в клетке и от условий существования организма. Включения имеют вид зерен, глыбок, капель, вакуолей, гранул различной величины и формы. Их химическая природа очень разнообразна. В зависимости от функционального назначения включения объединяют в группы: трофические, включения, секреты и инкреты, пигменты, экскреты и др. Среди трофических включений (запасных питательных веществ) важную роль играют жиры и углеводы. Белки как трофические включения используются лишь в редких случаях (в яйцеклетках в виде желточных зерен). Пигментные включения (желчные пигменты, мочевина и другие) придают клеткам и тканям определенную окраску. Секреты и инкреты (ферменты, нейромедиаторы, гормоны), синтезируются и накапливаются в железистых клетках, так как являются специфическими продуктами их функциональной активности. Экскреты – конечные продукты жизнедеятельности клетки, подлежащие удалению из нее.