1.7. Мероприятия по профилактики и ликвидации лейкоза

Одним из основных методов профилактики лейкоза является регулярные, через каждые 30-45 дней серологические исследования крови по РИД.

Серологический метод исследования.

Сущность метода — выявление при помощи РИД в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к ВЛКРС.

Пробы крови для исследований брали не ранее чем через 15 суток после введения животным вакцин или аллергенов, за 30 суток до отела и спустя такой же срок - после него.Серологическому исследованию на лейкоз подвергали сыворотки крови от животных в возрасте 6 мес.(телок) и старше.

Для постановки РИД использовали диагностический набор, который состоит из специфического антигена вируса лейкоза крупного рогатого ско та, специфической преципитирующей сыворотки к вирусу лейкоза крупно го рогатого скота, отрицательной сыворотки и других компонентов.

Кровь (для получения сыворотки) от исследуемых животных брали в бактериологические пробирки, направляли в районную государственную лабораторию ветеринарной медицины, выдерживали 1—2 ч в теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки образовавшийся сгус ток обводиди в пробирке, профломбированной после каждой пробы, сталь ной спицей (проволокой). После этого пробирки выдерживали в термостате в течение 20—24 ч при 4—10°С. Полученные пробы сыворотки сливали в пробирки Флоринского ( по 2—3 мл) и маркировали.

Рис.1. Последовательность и интервалы диагностических исследований на лейкоз

Компоненты реакции и подготовка их к работе. Лиофилизирован ный антиген, специфическую преципитирующую и отрицательную сыворотки растворяли дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке. Расплавленный агаровый гель, имеющий температуру 50—65°С, разливали слоем 2—3 мм в обезжиренные чашки Петри, установленные в горизонтальном положении, и оставляли их при комнатной температуре на 1 ч.

Рис.2. Штампы-пробойники для прорезания лунок в агаре с диаметром трубок 7 мм (1 - конструкции ВИЭВ); 6 мм (2 - конструкции ИЭВСиДВ); 5 мм (3 - конструкции УкрНИИЭВ).

В затвердевшем агаре с помощью штампа-пробойника прорезали лунки для тест-систем — для каждой тест-системы требуется семь лунок диаметром 5—7 мм: одна в центре и шесть по периферии, расстояние между лунками соответственно 2,5—3 мм (рис. 2).

Лиофилизированный антиген, контрольные и испытуемые сыворотки вносили в лунки пастеровскими пипетками, которые для каждого диагностикума были отдельные.

Антиген вносили в центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняли специфической преципитирующей сывороткой, четыре оставшиеся — испытуемыми (рис. 3).

Рис. 3. Лунки для тест-системы

После заполнения лунок чашки Петри выдерживали 48 ч при температуре 18—27°С в термостате (стеклянные пластинки — при той же температуре во влажной камере) (рис. 4).

Рис.4 . Влажная камера с чашками Петри

Реакцию учитывали через 48 ч в проходящем свете и оценивали при наличии четкой контрольной линии преципитации между антигеном и специфической преципитирующей сывороткой и отсутствии таковой с отрицательной контрольной сывороткой (рис. 5).

При оценке результатов реакции с испытуемыми сыворотками прежде всего устанавливали специфичность образовавшихся линий преципитации.

Рис. 5. Взаимное положение чашки Петри или стеклянной пластины с РИД и осветителя при учете реакции.

Специфической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном и соединяется с контрольной линией преципитации, то есть идентична ей (рис. 6).

Неспецифической считают линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя угол.

Рис. 6. Результат реакции иммунодиффузии с отрицательной (ОКС), положительной (ПКС), слабоположительной (СПКС) и положительной с антителами к р24 антигену ВЛКРС (ПКС-р24) контрольными сыворотками.

В зависимости от наличия специфических антител против ВЛКРС и типа получившихся линий преципитации реакцию оценивали как положительную или отрицательную.

Реакцию считают положительной, если между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном:

-образуется линия преципитации, которая соединяется с контрольной линией и идентична ей (см. рис. 6);

-линия преципитации отсутствует, но контрольная полоса образует изгиб вблизи лунки с испытуемой сывороткой к лунке с антигеном;

-кроме специфической линии преципитации, образуется дополнительная линия, которая располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой и обусловлена наличием антител к полипептидному антигену р24 ВЛКРС (см. рис. 6).

Реакцию считают отрицательной, если контрольная линия преципитации продолжается до лунки с испытуемой сывороткой без изгибов.

При наличии слабо различимого изгиба линии преципитации у лунки с испытуемой сывороткой животное исследуют вновь через три-четыре недели.

В случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется зона опалесценции вокруг лунок, реакцию переставляли.

При сдвиге контрольной линии преципитации в сторону лунок с антигеном проводили проверку компонентов реакции на активность в контрольной тест-системе.

Животных, сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД, считали зараженными вирусом лейкоза.

РИД положительные животные (содержащие изолированно от РИД –отрицательных) исследовались гематологическим методом исследования.

Метод заключается в количественной и качественной оценке лейкоци тов периферической крови животных, отнесенных по результатам РИД к группе инфицированных ВЛКРС.

При гематологическом исследовании осуществляли:

-подсчет количества лейкоцитов при помощи камеры Горяева;

-дифференцированный подсчет лейкоцитов в мазках (выведение лейкоформулы) или лимфоцитов при помощи электронного счетчика частиц «Культер»;

-оценку количества лейкоцитов и абсолютного количества лимфоцитов по "лейкозному ключу" (постановку гематологического диагноза).

Для количественной и качественной оценки лейкоцитов брали пробы крови в пробирки с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта используют трилон-Б (ЭДТА — динатриевая соль этилен диаминтетрауксусной кислоты) из расчета одна капля 10%-ного раствора (на дистиллированной воде) на 1 мл крови. Можно использовать гепарин из расчета 5 ЕД на 1 мл крови или 6 %-ный раствор лимоннокислого натрия (одна капля на 1 мл крови).

Для предотвращения свертывания крови пробирки сразу же (не отходя от исследуемого животного) закрывали резиновой пробкой и тщательно перемешивали, переводя попеременно пробирку из вертикального положения в горизонтальное.

Пробы крови исследовались не позднее 36 ч с момента их взятия.

Для проведения исследования готовились следующие растворы:

- раствор электролита — в 10 л дистиллированной воды растворяли 90 г хлористого натрия (х.ч.), 5 г трилона-Б, 10 мл 40 %-ного нейтрального формалина. Фильтровали его через 5-6 слоев фильтровальной бумаги. Индикаторной бумагой контролировали рН раствора, путем добавления трис-буфера доводили его до 6,0—7,2 (включая случаи, когда рН ниже 6,0);

Подсчет лейкоцитов в камере Горяева. В лунки полистироловых пластин разливали по 0,4 мл жидкости Тюрка. Состав жидкости Тюрка следующий: ледяная уксусная кислота 1—3 мл, 1 %-ный водный раствор метиленового синего или генцианвиолета, дистиллированная вода до 100 мл.

Стеклянным капилляром набирали предварительно перемешанную кровь до метки 0,02 мл (20 мм³). Марлевой салфеткой протираем наружную поверхность капилляра от крови и плавно выдуваем содержимое на дно пробирки (лунки) с жидкостью Тюрка. Несколько раз капилляр промываем, насасывая и выдувая содержимое пробирки (лунки).

Для следующего этапа работы готовили камеры Горяева, притирали к ним (со стороны сетки) шлифованные стекла (из комплекта камеры Горяева. В подготовленную для работы камеру Горяева при помощи глазной пипетки вносим разведенные в жидкости Тюрка (предварительно пропипетировав) пробы крови от двух животных. Для удобства учета проб в верхнюю половину вносим нечетные, а в нижнюю — четные пробы. Если в камере обнаруживали пузырьки воздуха, то ее перезаряжали вновь. Выждав 1—2 мин, пока клетки осядут, их подсчитываем под микроскопом при увеличении 10x10 или 10x20. Клетки подсчитываем в 25 больших квадратах (разделенных на 16 малых), начиная с левого верхнего угла сетки и далее сверху вниз (итого в пяти вертикальных рядах - по пять квадратов в ряду). В каждом квадрате считали клетки, находящиеся внутри, а также лежащие на левых и нижних линиях и в левых углах квадрата.

Для подсчета содержания лейкоцитов в 1 мкл крови число подсчитанных в 25 квадратах клеток умножали на 200.

Пробы, вызвавшие даже самое малое подозрение на лейкоцитоз, перепровелчлись подсчетом в 25 квадратах камеры, как указано выше.

Дифференцированный подсчет лейкоцитов (выведение лейкоцитарной формулы) проводили при обнаружении повышенного количества их. Для этих целей готовили мазки крови.

Мазки крови (приготовление и фиксирование).

Подготовка предметных стекол. Для приготовления мазков крови использовали чистые обезжиренные предметные стекла без царапин и шероховатостей. Новые стекла мыли в теплой мыльной воде, затем в проточной, протирали тампоном, смоченным смесью спирта и эфира, а затем сухой салфеткой.

Со стекол, бывших в употреблении, удаляли иммерсионное масло тампоном, смоченным ксилолом или бензином, после чего их помещаем на один—три дня в раствор двухромовой смеси (100 г двухромовокислого калия растворяли в 1 л горячей воды и постепенно приливали 100 мл концентрированной серной кислоты). Стекла промывали в проточной воде 1—2 сут., протирали сухой хлопчатобумажной тканью и заливали на 1 —2 сут. смесью спирта и эфира в равных частях. Затем стекла вновь насухо протирали чистой салфеткой и по 10—15 штук обертывали бумагой.

Мазки готовим из стабилизированной крови на обезжиренных предметных стеклах. Для предотвращения возможного травмирования клеток крови при производстве мазков, предметные стекла слегка подогревали (до температуры тела).

Для приготовления мазка стекло берем в левую руку между большим и указательным пальцами за короткие грани. Каплю крови наносим на правый конец стекла. Она должна быть такого размера, чтобы конец мазка, приготовленного из него, не доходил на 1 см до края стекла. Шлифованное стекло ставим впереди капли крови, надвигаем до прикосновения с ней и равномерным движением влево делаем мазок.

Хорошо приготовленный мазок должен быть тонким, ровным и при просмотре на свет отливать цветами радуги.

После высушивания на воздухе мазки маркировали простым каранда шом , указывая номер экспертизы, инвентарный номер или кличку живот ного, дату приготовления мазка, и фиксировали в метиловом спирте 3—5 мин, этиловом спирте — 20-30, жидкости Никифорова (смесь равных час тей этилового спирта и эфира) — 15—20 или ацетоне — 5 мин. (В зависи мости от наличия реактивов).

Окраска мазков крови. Окраска по Романовскому—Гимза. Окрашивали мазки в течение 20—30 мин. краской Романовского — Гимза в чашках Петри. Затем краску многократно смывали дистиллированной водой и мазки высушивали на воздухе. Качество окраски контролировали под микроскопом. В правильно окрашенном мазке ядра клеток приобретали красно-фиолетовый цвет, 16 цитоплазма лимфоцитов — голубой, а цитоплазма нейтрофилов — розовый.

Лейкоцитарную формулу выводили по результатам дифференцированного подсчета 100 клеток в окрашенных мазках крови под микроскопом с иммерсионной системой. При подсчете предметное стекло продвигали по зигзагообразной линии в направлении к концу мазка. Для счета дифференцированных клеток использовали клавишный счетчик. Количество отдельных элементов крови в лейкоцитарной формуле выражают в процентах.