2.5. Диагностика. Дифференциальный диагноз.

Лабораторная диагностика. Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков болезни (расстройство акта дыхания, кашель, удушье, поражение глаз, откашливание слизи с примесью крови), патологоанатомических изменений (геморрагическое и катаральное воспаления слизистой оболочки гортани и трахеи, фибринозные массы в конъюнктивальном мешке, казеозные пробки в просвете гортани) и результатов лабораторных исследований. Часто болезнь протекает атипично, характерные признаки ее слабо выражены или их нет. В таких случаях решающее значение в диагностике приобретают лабораторные методы исследования [8].

Выделение вируса.

Взятие и подготовка материала. Для вирусологического исследования от больных птиц берут экссудат из трахеи, от павших или вынужденно убитых в начальной фазе болезни (между 2-7 днями) - слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы, носовых ходов и кусочки легких. Материал замораживают и сохраняют при минус 20 °С и ниже. Для гистологических исследований материал помещают в 10%-ный раствор нейтрального формалина.

Из патологического материала готовят суспензию 1 : 5 на растворе Хенкса или изотоническом растворе NaCl, центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 15 мин, к надосадочной жидкости добавляют по 1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина в расчете на 1 мл, выдерживают в течение 3- 8 ч при 2-4 °С. Затем используют для инокуляции КЭ, культуры клеток или молодых не иммунных к инфекционному ларинготрахеиту цыплят.

Заражение куриных эмбрионов. Для каждой пробы используют по 10 эмбрионов 9-12-дневного возраста. Заражают на ХАО. Погибших за первые 24 ч после инокуляции эмбрионов не учитывают. Оставшихся живых эмбрионов на 6-8-й день убивают. Макроскопические изменения ХАО появляются через 2,5-3 суток и достигают максимума к 5-6-му дню. Штаммы вируса инфекционного ларинготрахеита вызывают мелкоузелковые и очаговые поражения хорионаллантоиса. Узелковые поражения обнаруживаются по всей поверхности хорионаллантоиса, очаговые - только на месте инокуляции вируса. Необходимо учитывать, что не все штаммы вызывают гибель куриных эмбрионов на 4-6-й день. Для выявления специфических поражений необходимо проведение не менее трех пассажей, используя ХАО, суспензированную в аллантоисной жидкости предыдущего пассажа.

Выделение вируса надо подтвердить обнаружением телец-включений Зейстрида, РН, РДП, биопробой, а также РИФ и электронной микроскопией.

Заражение культур клеток. Наиболее пригодны в данном случае культуры клеток почек эмбриона и цыплят, в которых первые изменения наблюдаются иногда уже через 24 ч после заражения, а через 48-72 ч в клеточной культуре обнаруживаются многоядерные гигантские клетки, в которых можно обнаружить внутриядерные включения. Специфичность этих изменений доказывают в РИФ или РН. Наблюдение за культурой клеток проводят до 6-7 дней [10].

Индикация и идентификация вируса.

Обнаружение специфических телец-включений. Вирус инфекционного ларинготрахеита размножается в эпителиальных клетках слизистой оболоки гортани, трахеи, клоаки, вызывая острое воспаление этих оболочек с образованием внутриядерных включений. Включения обнаруживаются до наступления некроза эпителия между первым и пятым днями после интратрахеального заражения цыплят. В мазках из конъюнктивы включения находят через 48 ч после заражения. Ядро, содержащее включение, обычно увеличено, отмечается гиперхромация ядерной оболочки. Включения имеют округлую форму, иногда форму диплококков и занимают 2/3 клеточного ядра. Вокруг включения видна неокрашенная зона, что считается характерным. Болезнь можно диагностировать на основании обнаружения внутриядерных включений. Для этого на предметных стеклах готовят мазки из соскобов эпителия слизистой оболочки, фиксируют в абсолютном метиловом спирте в течение 3-5 минут, окрашивают раствором краски Гимза (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 2 ч при 37 °С, затем мазки промывают, обрабатывают абсолютным метиловым спиртом, снова промывают, высушивают и просматривают. В положительных случаях цитоплазма эпителиальных клеток окрашивается в бледно-голубой цвет, ядерные оболочки таких клеток более темные, внутриядерные включения четко видны, светло-красного цвета, по форме варьируют (шарообразные или колбасовидные), окружены ясно видимыми светлыми ободками. Количество их в ядре от 1 до 4. Указанный метод позволяет иногда в течение 3-4 часов диагностировать инфекционный ларинготрахеит даже при атипичном проявлении. Вероятность обнаружения телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни - между 2-м и 7-м днями.

РИФ. Данный метод позволяет обнаружить вирусный антиген при помощи специфической флюоресцирующей сыворотки в мазках из слизистой оболочки трахеи, конъюнктивы от больных цыплят (в период острого течения болезни), из пораженной ХАО и инфицированных культур клеток. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще используют прямой метод. Положительную флюоресценцию в мазках от больной птицы наблюдают в период острого течения болезни, когда обнаруживаются внутриядерные включения и можно выделить вирус на эмбрионах кур.

Биопроба. Ставят ее на цыплятах 30-90-дневного возраста путем аппликации вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, трахеи, глаз, носа, подглазничного синуса, клоаки. При наличии вируса в исследуемом материале у зараженных цыплят на 6-12-й день развиваются типичные клинические признаки экспериментальной инфекции. При инокуляции материала в подглазничный синус в положительных случаях развивается синусит с отеком, выделениями из носовых ходов и слезотечением. Положительная реакция на клоачную пробу проявляется с 3-го по 8-й день, но чаще - на 4-5-й день в виде отечности слизистой оболочки фабрициевой сумки и катарального, геморрагического или фибринозного воспаления.

Наблюдение за зараженными цыплятами ведут до 14 дней. Чаще всего заражение цыплят проводят на слизистую оболочку трахеи и клоаки, так как этот метод позволяет определить вирулентность штамма, а также провести дифференциацию его от вирусов, вызывающих сходное поражение ХАО у инфицированных куриных эмбрионов. При интратрахеальном заражении 4-недельных цыплят вирулентным штаммом инфекционного ларинготрахеита CS-1 наибольший титр вируса в тканях трахеи установлен на 2-4-е сутки. Позднее количество вируса резко снижалось, и на 7-й день его не обнаруживали, хотя антиген вируса в эпителии трахеи в большом количестве выявляли на 7-е и 8-е сутки с помощью флюоресцирующих антител [5].

Последнее время естественные инфекции все чаще протекают в нетипичной, абортивной, хронической или даже бессимптомной формах. Выделяемые штаммы также менее патогенны для куриных эмбрионов, не всегда приводят к их гибели и даже не всегда вызывают патологические изменения на слизистых оболочках при непосредственном введении исследуемого материала.

РН на куриных эмбрионах. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще всего в диагностической практике используют метод: разведение вируса и постоянная доза сыворотки. Результаты РН выражают в индексах нейтрализации. Принято индексы нейтрализации от 1 до 9 считать отрицательными, от 10 до 49 - сомнительными, от 50 и выше - положительными. РН можно проводить и на культурах клеток почек куриного эмбриона и 3 - 8-дневных цыплят.

РДП. Для идентификации возбудителя в РДП используют набор куриных антисывороток, полученных к различным вирусам птиц. РДП ставят по общепринятой методике. Согласно стандарту СЭВ для РДП при диагностике инфекционного ларинготрахеита птиц 1,5%-ный агаровый гель готовят на вероналовом буферном растворе с рН 7,2, который готовят следующим образом: в 100 мл горячей дистиллированной воды растворяют 1,84 г веронала, после охлаждения доливают дистиллированной водой до 1000 мл и растворяют в полученном растворе 10,3 г мединала. Раствор хранят при 4°С.

В среднюю лунку помещают исследуемый антиген, а в периферийные лунки - гипериммунные преципитирующие сыворотки. Специфические линии преципитации появляются через 24-48 ч, однако в некоторых случаях они появляются к 72 ч и располагаются между средней линией и лункой, содержащей сыворотку.

Реакция проста по технике выполнения и позволяет выявлять примерно 75% положительных случаев, установленных при помощи заражения эмбрионов. РДП специфична, но недостаточно чувствительна, ее используют главным образом для ретроспективной диагностики среди взрослых кур.

Приготовление гипериммунных сывороток и антигенов. Гипериммунные вируснейтрализующие сыворотки получают на кроликах по следующей схеме: виру (суспензии хорионаллантоисных оболочек 1:10, после центрифугирования при 2500 об/мин в течение 30 мин) вводят кроликам внутривенно в течение 3 недель по 3 раза в неделю (через день) в первую неделю - по 2 мл, во вторую - по 3, в третью - по 4 мл. Через 7 недель после первичной иммунизации кролику внутрибрюшинно инъецируют 10 мл вируса, а на следующий день - 15 мл внутривенно. Через 7 дней после последнего введения антигена кроликов обескровливают. Гипериммунные кроличьи сыворотки используют в РН для типирования вируса инфекционного ларинготрахеита [6].

Получение гипериммунных преципитирующих сывороток на птице. Центрифугированную суспензию хорионаллантоисной оболочки в разведении 1 : 10 вводят взрослым петухам в подкрыльцовую вену в объеме 1 2 мл но схеме. четыре инъекции с промежутками в один день; 7 дней отдыха; четыре инъекции с промежутками в один день. На 6-й день после последней инъекции пробно берут кровь из сердца; в случае неактивности сыворотки проводят трехкратное введение вируса с суточными интервалами; на 6-й день вторично берут пробу крови.

Идентификация вируса с помощью моноклональных антител. По чувствительности ИФА-тест с моноклональными антителами сопоставим с методом выделения вируса, но более быстрым и более чувствительным по сравнению с иммунофлюоресценцией.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В нетипичных случаях, особенно при хроническом течении инфекции, провести диагностику позволяет установление роста титра антител при исследовании парных сывороток. Однако такого рода исследования проводятся главным образом с целью получения данных, свидетельствующих о перенесении заболевания данной популяцией и указывающих на степень распространенности возбудителя на определённой территории.

Пробы сыворотки от птицы исследуют дважды - через 14-28-дневный интервал. Повышение титра антител к вирусу и числа положительно реагирующих птиц в стаде свидетельствует о наличии и распространении инфекции в хозяйстве, а сохранение или снижение уровня антител о прошедшей инфекции.

Для серологического исследования кровь берут на 14-й и 28-й дни от начала болезни не менее чем от 5-10 птиц по 5 мл от каждой. До начала исследования сыворотку сохраняют в замороженном состоянии при минус 20- 70 °С. Сыворотки (больных и переболевших птиц, а также контрольные) инактивируют при 56 °С 30 мин.

Приготовление антигенов для РН и РДП. Хорионаллантоисные оболочки куриных эмбрионов с характерными для данного вируса поражениями гомогенизируют с равным количеством буферного изотонического раствора с рН 7,2-7,4, к которому добавлены антибиотики из расчета по 100 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл раствора. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин. Надосадочную жидкость сливают и используют в качестве антигена, если она содержит вируса не менее 10:> ЭИДяо/мл. Антиген сохраняют в замороженном состоянии.

Предложена следующая методика концентрации и очистки вируса: вируссодержащий материал концентрируют полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000; конечная концентрация его в вируссодержащей суспензии равна 7%; концентрирование ведут при 4 °С в течение 3 ч, центрифугируют концентрированный вирус при 3000 об/мин 30 мин.

РН. На куриных эмбрионах или культурах клеток ставят по общепринятой методике, чаще используют модификацию: постоянная доза сыворотки и различные разведения вируса. Число рядов соответствует числу испытуемых сывороток плюс два ряда контроля (с нормальной и иммунном сыворотками), а число пробирок в ряду - числу разведений вируса. После контакта (1 ч при комнатной температуре) смесь сыворотки с каждым разведением вируса инокулируют не менее чем четырем куриным эмбрионам на ХАО по 0,2 мл. Эмбрионы инкубируют при 37 °С в течение 6 дней. При вскрытии выявляют специфические изменения на ХАО. В РН рекомендуется использовать неразведенные сыворотки. Оценку результатов реакции проводят по индексу нейтрализации. Сыворотку с индексом нейтрализации 10 или меньше считают отрицательной, а с индексом больше 10 - положительной.

РДП. Проводят по общепринятой методике, используя стандартный антиген. Эта реакция может выявить 25-50% переболевших птиц. Однако простая техника постановки ее и быстрое получение результатов дают возможность с минимальными затратами средств и времени обследовать большое количество птицы. ELISA-метод. Оказался более чувствительным, чем РН, по чувствительности приближается к РИФ. У отдельных экспериментально зараженных цыплят с помощью ELISA-метода и РИФ удавалось выявить антитела в более ранние сроки, чем в РН.

ELISA-метод и РН (микрометод) успешно применяли для обнаружения антител в стадах с субклиническим течением инфекционного ларинготрахеита. Обнаружить поствакцинальные антитела к вирусу болезни в сыворотках цыплят с помощью ELISA-метода удается через неделю после вакцинации.

Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза исключают Ньюкаслскую болезнь, оспу, ИБК, заразный насморк, хронический пастереллез, респираторный микоплазмоз.

Дифференциальная диагностика.

Инфекционный ларинготрахеит птиц необходимо дифференцировать от таких респираторных заболеваний как инфекционный бронхит кур, гриппа кур, инфекционной бурсальной болезни, респираторного микоплазмоза, гемофилеза.

Инфекционный бронхит.

К инфекционному бронхиту восприимчивы куры различных возрастных групп (в основном цыплята), у взрослых птиц заболевание сопровождается поражением герминативных органов, приводящим к длительному снижению яйценоскости.

Патологоанатомическая картина: гиперемия слизистой оболочки носа, подглазничных синусов, трахеит, бронхит, ринит, недоразвитость яичников.

Способы иссоледования:

- Вирусологический (при проведении серийных пассажей на 8 -ми дневных куриных эмбрионах отмечается эффект карликовости и мумификации).

- Серологический (Обнаружение специфических антител в РН, РДП, РНГА).

Инфекционный ларинготрахеит

Восприимчивы куры, индейки, фазаны. Наиболее воприимчивы куры в период яйцекладки.

Патологоанатомическая картина характеризуется катаральными реже геморрагическими пробками в трахее, кровоизлияниями на слизистой оболочке гортани, в коньюнктивальном мешке обнаруживают казеозные масы

Способы исследования:

- Вирусологический (вирус вызывает на харионной оболочке образование специфических узелков).

- Серологический (вирус вызывает образование вируснейтрализующих и вирусспецифических антител).

Грипп кур.

Восприимчивость в естественных условиях неоднородна и зависит от подтипа вируса.

Патологоанатомическая картина характеризуется гастроэнтеритами, кровоизлияниями на серозной оболочке паренхиматозных органах, некрозом селезёнки.

Способы исследования:

- Вирусологический (Заражение куриных эмбрионов на харионную оболочку)

- Серологический (РЗГА, РСК, РН).

Инфекционная бурсальная болезнь.

Восприимчивы куры всех возрастных групп.

Патолого-анатомическая картина характеризуется увеличением почек, изменением их цвета от темно-серого до тёмно-коричневого. Канальца и мочеточники заполнены уратами и четко очерчены.

Способы исследования:

- Вирусологический (Выделение вируса на куриных эмбрионах, наибольшая концентрация вируса на харионной оболочке)

- Серологический (РН, РДП).

Респираторный микоплазмоз.

Восприимчивы куры, индейки и фазаны.

Патолого-анатомическая картина характеризуется аэросаккулитами, ринитами и синуситами.

Способы исследования:

- Бактериологический (посевы на специальные питательные среды и выделение микоплазм)

- Серологический (Сывороточно-капельная агглютинация, РДП).

Гемофилёз.

Восприимчивы индейки, реже водоплавающие птицы.

Патолого-анатомическая картина характеризуется скопление слизи в носовой полости, кератитами, коньюктивитами.

Способы исследования:

- Микробиологические (посевы патологического материала на кровяные среды) [5].