Репликация днк

Репликация молекул ДНК происходит в синтетический период интерфазы. Каждая из 2 цепей «материнской» молекулы служит матрицей для синтеза новой цепи по принципу комплементарности. После репликации молекула ДНК со­держит одну "материнскую" цепочку и одну "дочернюю", вновь синтезированную (син­тез ДНК является полуконсервативным). Так как две компле­ментарные цепи в молекуле ДНК направлены в противопо­ложные стороны, а ДНК-полимераза может продвигаться вдоль матричных цепей лишь от 5'- конца к 3'-кониу, то син­тез новых цепей идет антипараллельно (принцип антипараллельности).

Для матричного синтеза новой молекулы ДНК необходи­мо, чтобы старая молекула была деспирализована и вытянута. Но одновременное раскручивание спиралей, состоящих из огромного числа пар нуклеотидов (нескольких миллионов), невозможно. Поэтому репликация начинается в нескольких местах молекулы ДНК. Участок молекулы ДНК от точки на­чала одной репликации до точки начала другой называется репликоном. В бактериальную хромосому входит один репликон. Эукариотическая хромосома содержит много репликонов, в которых удвоение молекулы ДНК идет одновре­менно. Репликон обязательно имеет контролирующие эле­менты: точку начала, в которой инициируется репликация, она определяется праймерами (затравками), состоящими из 10—200 пар нуклеотидов, и точку окончания, в которой репли­кация останавливается. Место, в котором происходит репли­кация, получило название репликационной вилки. В репликационной вилке ферменты ДНК-топоизомеразы раскручивают двойную цепочку ДНК, а хеликазы разрывают водородные связи между ее цепочками, Репликационная вилка постепен­но движется вдоль молекулы ДНК от ее стартовой точки (точ­ки начала) до точки окончания. Так как ДНК-полимераза мо­жет двигаться только в одном направлении (5'-3'), то в каж­дой репликационной вилке она может постепенно и непре­рывно строить лишь одну новую цепь молекулы ДНК. Другая дочерняя молекула ДНК по мере расплетания материнской молекулы синтезируется отдельными короткими участками по 150—200 нуклеотидов (фрагменты Оказаки) под действием фермента ДНК-полимеразы, движущегося в противополож­ном направлении. Эти короткие участки вновь синтезируе­мой полинуклеотидной цепи одного репликона связываются воедино ферментом лигазой. Такой принцип синтеза новых цепей ДНК называется прерывистым. Ферменты ДНК-топо­изомеразы скручивают нити реплицированных участков ДНК. Участки "дочерних" молекул ДНК, синтезированные в соседних репликонах, также "сшиваются" ферментом лигазой. Весь геном клетки реплицируется только один раз за пери­од времени, соответствующий одному митотическому циклу.

Методы рекомбинантной днк

Методы рекомбннантной ДНК позволяют анализи­ровать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

Метод клонирования ДНК позволяет Изолиро­вать отдельные гены или их фрагменты (ферменты рестрикта-

Генетика человека 169

зы), создавать неограниченное количество их копий (фермент ДНК-полимераза), транскрибировать (фермент РНК-лолимераза) и транслировать изолированные гены (получать ко­дируемые полипептиды), что стало возможным благодаря от­крытию ферментов - рестриктаз. Разные рестриктазы "распо­знают" различные последовательности нуклеотидов и "разре­зают" ДНК в разных местах - сайтах, что позволяет выделять отдельные гены.

Метод гибридизации нуклеиновых кислот позволяет устанавливать порядок нуклеотидов в молекуле ДНК и обнаруживать единственный ген среди десятков ты­сяч. Линейные отрезки двухцепочечной ДНК (выделенные с помощью рестриктаз) подвергают тепловой обработке и полу­чают одноцепочечные фрагменты (денатурирование). Далее денатурированную ДНК инкубируют при таких условиях (t= 37 °С), когда происходит гибридизация, т. е. взаимное распознавание двух комплементарных нитей посредством спаривания азотистых оснований. Часто для идентификации порядка нуклеотидов используют в качестве зонда одну ра­диоактивную нить ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. Гомологичные последовательности можно идентифицировать как полностью, так и частично. Ра1лич-ные модификации этого метода позволяют в клинике анали­зировать очень малые количества ДНК, взятые у больного.

Для успешного применения в практическом здравоохране­нии методов рекомбинантной ДНК необходимо создание биб­лиотек радиоактивных зондом всех последовательностей ДНК генома человека, и в этом направлении уже многое сделано.