Культивирование анаэробных микроорганизмов

Специфика культивирования анаэробов заключается в защите их от кислорода воздуха. Для этого применяют следующие приемы: 1) жидкую среду перед посевом подогревают в кипящей водяной бане, быстро охлаждают и заливают высоким слоем до пробки в сосуды для культивирования; 2) сосуды закрывают стерильными резиновыми пробками; 3) откачивают воздух из сосудов для культивирования и заполняют их инертным газом; 4) выращивают культуру в толще агаризованной среды и т. д. Последний прием используют для получения изолированных колоний при выделении чистых культур и необходимости количественного учета факультативно-анаэробных организмов. Засев питательной среды факультативно-анаэробными микроорганизмами осуществляют глубинным способом: посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до 48–50 С агаризованную среду, перемешивают, переливают до пробки в стерильные сосуды для культивирования, плотно закрывают и заливают расплавленным парафином.

При выделении чистых культур и количественном учете анаэробных микроорганизмов анаэробные условия создаются с помощью химических реагентов либо путем физического удаления воздуха из емкостей, в которых проводится выращивание микроорганизмов.

Новейшими приемами культивирования анаэробных микроорганизмов являются:

1) культивирование в анаэробных камерах (камера заполняется газами, освобожденными от примесей кислорода, все манипуляции в камере проводят, используя вмонтированные в камеру газонепроницаемые перчатки);

2) культивирование в анаэробных камерах типа анаэростатов с использованием палладиевого катализатора, поглощающего кислород и т. д.

Задание

1. Приготовить 100 мл мясопептонного бульона (МПБ).

2. Приготовить 100 мл мясопептонного агара (МПА).

3. Приготовить 100 мл среды Эндо.

4. Простерилизовать питательные среды в автоклаве.

Контрольные вопросы

1. Питательные среды для микроорганизмов. Их характеристика.

2. Условия культивирования микроорганизмов. Влияние факторов окружающей среды на рост и размножение микроорганизмов.

3. Требования, предъявляемые к питательным средам.

4. Методы, аппаратура и режимы стерилизации.

5. Способы стерилизации.

6. Особенности термической обработки питательных сред.

7. Особенности «холодных» методов стерилизации.

8. Факторы, оказывающие влияние на выбор методов и режимов стерилизации.

9. Стерилизация посуды и инструментов.

Лабораторная работа № 2 Методы определения количества клеток микроорганизмов

Для определения общего количества микроорганизмов в различных субстратах, выявления численности представителей отдельных групп микроорганизмов используют ряд методов:

– прямой подсчет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных препаратах, на мембранных фильтрах);

– выделение и учет посевом на плотные питательные среды в чашки Петри (метод Коха);

– подсчет путем высева в жидкие питательные среды (метод предельных разведений).

Методы прямого подсчета клеток под микроскопом дают возможность наиболее полно учесть численность микроорганизмов в субстрате, так как при окрашивании клеток красителем можно определить состояние клетки (живая клетка или мертвая).

Если предполагаемое количество клеток на 1 см³ менее 10⁶ клеток, то для определения их числа пригоден метод мембранных фильтров. Воду, суспензию или раствор пропускают через мембранный фильтр, затем фильтр сушат, окрашивают, просветляют и производят подсчет под микроскопом.

При методах посева на плотные и в жидкие питательные среды учитываются только жизнеспособные клетки. Живыми считаются те клетки, которые могут образовывать колонии на агаризованной среде либо суспензию в питательном растворе. Для выделения и подсчета как можно более широкого круга микроорганизмов используют метод Коха и подбирают такую среду, на которой способны развиваться микроорганизмы с различными свойствами.

Во время роста периодической культуры не всегда наблюдается строгая пропорциональность между увеличением числа клеток и увеличением микробной биомассы. Выбор метода определения биомассы зависит от цели. Для оценки урожая обычно взвешивают сырье или сухие отцентрифугированные клетки. При определении интенсивности обмена или ферментативной активности исходят из содержания в клетках белка или азота.

Приборы и материалы: микроскоп типа биолам, фотоэлектроколориметр (ФЭК-56), термостат, емкость с водой, фильтровальная бумага, дистиллированная вода, дрожжевая культура, пробирки со стерильной водопроводной водой, стерильные пипетки, камера Горяева, стерильные чашки Петри, шпатель, спиртовка, спички, бактериологическая петля, суспензия дрожжей.