5. Что такое селективный скрининг? Для чего его применяют?

Применяют для отбора трансформированных клеток, содержащих экспрессионную плазмиду, и для поддержания стабильности плазмидной ДНК во время культивирования. В первом случае важно идентифицировать клетки, содержащие плазмиды с целевым геном, и отделить их от нетрансформированных клеток и клеток, несущих «пустую» плазмиду.

Маркером может служить устойчивость к антибиотикам. Клетки, не содержащие плазмидную конструкцию, не способны расти на среде с антибиотиками и погибают. Этот метод позволяет эффективно отделить трансформированные клетки от нетрансформированных, но не позволяет отделить клетки, несущие плазмиду с целевым геном, от клеток с «пустой» плазмидой.

6. Для чего добавляют антибиотик и арабинозу в агар для выращивания клеток, трансформированных плазмидой pGlo? Какие признаки мы можем наблюдать при таком выращивании?

Антибиотик добавляют для того, чтобы исключить рост не трансформированных клеток. Трансформированные клетки имеют устойчивость к антибиотику из-за гена, кодирующего В-лактамазу, которая обеспечивает устойчивость к ампициллину. Арабиноза действует как индуктор, нужна для активации арабинозного оперона, который контролирует экспрессию белка в клетке. Признаки: наличие посторонних колоний.

7. Как рассчитать эффективность трансформации? От чего она зависит?

Эфф. трансф. = число колоний на чашке / кол-во ДНК на чашку (мкг)

Эффективность трансформации зависит от состояния клеток, от качества плазмидной ДНК, ее снижают субъективные ошибки экспериментатора (перемешивание, heat shock, пипетирование, высев клеток на чашку, перегрев клеток). Максимальная эффективность трансформации достигается качеством работы.

8. Какие организмы используются в биотехнологии в качестве клеток-хозяев для биосинтеза белка?

Происхождение большинства лабораторных и промышленных штаммов E. coli восходит к штамму линии K-12 или к штамму линии B. Особенностью этих штаммов является наличие мутаций, которые обеспечивают высокий выход и качество экспрессируемых плазмид.

Использование этого вида бактерий связано с тем, что E. coli – один из наиболее изученных организмов. Получена исчерпывающая информация о его генетике, биохимии, физиологии, разработаны хорошие системы векторов для экспрессии чужеродной информации в клетках этого вида бактерий, подобраны питательные среды и условия культивирования.

9. Что такое рекомбинантные белки и как их получают?

Рекомбинантные белки - результат новых комбинаций генов, которые формируют ДНК. Рекомбинантные белки получены на основе клонированных последовательностей ДНК, которые обычно кодируют ферменты и белки с известными функциями.

Рекомбинантные белки — это белки, ДНК которых была создана искусственно.

Технологии рекомбинантных ДНК – это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает работать.

1. Получение нужной последовательности – синтез ДНК методом ПЦР

2. После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК». Вектор для клонирования – молекула ДНК, способная к включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, служит инструментом для введения генетической информации в клетку. То есть является молекулой-носителем для клонируемой ДНК.

3. Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень, где она реплицируется и передается потомкам. В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо встроиться в хромосому клетки-хозяина.

4. Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. (высев клеток на среду с антибиотиком)

5. Наращивание бактериальной массы

6. Индукция синтеза целевого продукта, добавляют определенное вещество, которое запускает синтез нужного белка. Растут до определённой плотности

7. Этап получения телец включения, (центрифугирования биомассы и разрушение ультразвуком, очистка, растворение,

8. Рефолдинг

9. Получение высоко отчищенного препарата (обессоливание, ионообменная хроматография, гель-фильтрация)