- •Что такое генетическая трансформация? Какие способы трансформации бактериальных клеток существуют?
- •Какими свойствами обладают компетентные клетки и для чего они используются?
- •Опишите структуру экспрессионной плазмиды. За какие функции отвечает каждый из ее участков?
- •Что такое бактериальный оперон? Опишите структуру и принцип работы арабинозного оперона.
- •Что такое селективный скрининг? Для чего его применяют?
- •Для чего добавляют антибиотик и арабинозу в агар для выращивания клеток, трансформированных плазмидой pGlo? Какие признаки мы можем наблюдать при таком выращивании?
- •Как рассчитать эффективность трансформации? От чего она зависит?
- •Какие организмы используются в биотехнологии в качестве клеток-хозяев для биосинтеза белка?
- •Что такое рекомбинантные белки и как их получают?
- •Какими свойствами должен обладать экспрессионный бактериальный штамм для успешной экспрессии генов белков?
- •Какие вещества и в каких случаях используют для регуляции экспрессии гена целевого белка в бактериальных экспрессионных системах?
- •Для чего нужна регуляция экспрессии гена и каким образом она осуществляется?
- •Что такое иптг? Что происходит в трансформированных клетках после его добавления в питательную среду?
- •В каких отделах клетки и в какой форме может осуществляться накопление белка при экспрессии гена?
- •Ген экспрессируемого в е.Coli белка находится под промотором рнк полимеразы фага т7. Какие гены должны присутствовать в клетке-хозяине, чтобы экспрессия была эффективной?
- •В каких условиях производится культивирование трансформированных клеток е.Coli bl21?
- •Какие преимущества и недостатки получения целевого белка в растворимой форме при экспрессии его гена в бактериальной культуре?
- •Что такое “тельца включения”? Какие преимущества и недостатки они дают при выделении рекомбинантных белков?
- •Какими растворами промывают “тельца включения” для подготовки к очистке? Для чего используется каждый этап промывки?
- •Какие методы используют для разрушения бактериальных клеток?
- •Какие существуют виды хроматографии по механизму разделения веществ? Каковы особенности каждого вида?
- •Как происходит разделение веществ при ионообменной и аффинной хроматографиях?
- •Какие вещества мешают определению концентрации белка колориметрическими методами и каким образом можно от них избавиться?
- •Опишите принцип определения концентрации белка по Лоури.
- •Какими способами осуществляют денатурацию белков при проведении электрофореза?
- •Какие подложки используют для проведения электрофореза и какие преимущества и недостатки они имеют?
- •Что такое полиакриламидный гель? Как он формируется?
- •Из каких участков состоит пааг для разделения белков и для чего служит каждый из них?
- •Для чего в состав пааг и разделяемых образцов вводят дсн?
- •Какими методами осуществляют визуализацию разделенных с помощью электрофореза молекул?
Для чего нужна регуляция экспрессии гена и каким образом она осуществляется?
Регулировать экспрессию белка необходимо поскольку, экспрессия чужеродного белка может привести к гибели бактерии-хозяина, к тому же плазмиды могут утрачиваться после нескольких клеточных циклов. Экспрессия белка – это синтез белков в клетке, под контролем определенных генов. Длинный процесс с транскрипцией ДНК, получением РНК и преобразованием его в активный белок.
В биотехнологических экспрессионных системах регуляция экспрессии нужна для оптимизации роста культуры клеток с целью получения максимального количества целевого белка. В частности, бактериальные клетки в культуре без экспрессионной нагрузки демонстрируют логарифмический характер роста. Индукцию экспрессии рекомбинантного белка начинают в средней фазе роста, когда оптическая плотность клеточной культуры достигает OD600 ~ 0.6-0.7 оптических единиц. После добавления индуктора запускается процесс синтеза целевого белка, а деление клеток при этом замедляется, постепенно выходя в стационарную фазу. Если индуктор добавлять сразу, то клеток в культуре будет мало, что снизит выход белка, если же добавить в позднюю фазу роста, то при большом количестве клеток белка будет мало, так как ресурсы питательной среды уже будут истощены и их будет недостаточно для синтеза.
Для этого используются сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов E. соli; специально сконструированный tac-промотор, включающий — 10-область lас-промотора и — 35-область trp-промотора; промотор бактериофага λ; промотор гена бактериофага Т7. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции генов. Так, lac-оперон в отсутствии лактозы находится в репрессируемом состоянии. Включение lac-оперона или происходит при добавлении в среду лактозы или ИПТГ, т.е. возобновляется транскрипция.
Ну и еще можно упомянуть арабинозный промотор, с которым мы, собственно, и работали.
Что такое иптг? Что происходит в трансформированных клетках после его добавления в питательную среду?
ИПТГ – изопропил-β-D-тиогалактопиранозид – индуктор lac-оперона, который контролирует процесс транскрипции. В технологии рекомбинантных ДНК используется для индукции клонированных генов.
ИПТГ предотвращает связывание белка-репрессора с lac-опероном, что возобновляет транскрипцию, и как следствие запускает синтез нужного белка.