14. В каких отделах клетки и в какой форме может осуществляться накопление белка при экспрессии гена?

    Локализация целевого белка	Достоинства	Недостатки
    Секретироваться в культу­ральную среду (при нали­чии в экспрессионной кон­струкции лидерного пеп­тида)	Нет загрязнения клеточ­ными белками, отсутствие клеточных протеаз	Низкая концентрация целе­вого белка, большой объем культуры, требующий кон­центрирования
    Секретироваться в пе­риплазму (при наличии в экспрессионной конструк­ции лидерного пептида)	Небольшое количество балластных белков, пра­вильный фолдинг целевого белка	Маленькое количество це­левого белка из-за ограни­ченного пространства
    Накапливаться в цито­плазме клетки-хозяина в растворимой форме	Правильный фолдинг целе­вого белка, нет необходи­мости переводить белок в растворимую форму	Наличие клеточных про­теаз, большое количество балластных белков, труд­ности очистки
    Накапливаться в цито­плазме клетки-хозяина в виде нерастворимых телец включения	Высокая чистота препа­рата, легкость очистки це­левого белка	Сложности фолдинга целе­вого белка, необходимость перевода белка в раствори­мую форму

15. Ген экспрессируемого в е.Coli белка находится под промотором рнк полимеразы фага т7. Какие гены должны присутствовать в клетке-хозяине, чтобы экспрессия была эффективной?

Промотор бактериофага Т7 является сильным промотором и обеспечивает очень высокий уровень транскрипции целевых генов. Для транскрипции гена под контролем Т7 необходима РНК полимераза бактериофага T7. Данный фермент очень активен и высоко специфичен к последовательности промотора бактериофага T7. Транскрипция гена в плазмиде под управлением T7 промотора может быть запущена после синтеза T7 полимеразы ген, который встроенной в геном штамма-продуцента в виде профага (λDE3). Ген полимеразы, в свою очередь, может находиться под управлением индуцируемого промотора, такого как lac. T7 промоторы используются во многих коммерческих экспрессионных системах и включается при добавлении ИПТГ.

16. В каких условиях производится культивирование трансформированных клеток е.Coli bl21?

Клетки штамма E. coli BL21(DE3), культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин с постоянным перемешиванием при 37°С до плотности OD590нм = 0,8. Индукцию синтеза белка проводили добавлением в культуральную среду ИПТГ (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид), и культивировали еще в течение 3-х часов в тех же условиях. Клетки осаждали центрифугированием (5000g, 20 мин, 4°С).

17. Какие преимущества и недостатки получения целевого белка в растворимой форме при экспрессии его гена в бактериальной культуре?

Экспрессия белков в растворимой форме дешевле, быстрее, так как нет проблем с фолдингом и с дополнительным растворением белка, как в случае с тельцами включения. Недостатки– нестабильность (доступность для протеаз), сложность очистки (так как есть риск повредить белок растворителем).

18. Что такое “тельца включения”? Какие преимущества и недостатки они дают при выделении рекомбинантных белков?

Тельца включения — это нерастворимые белковые агрегаты, образующиеся при суперэкспрессии (чрезмерная активность гена, который производит избыточное количество белка) рекомбинантных белков у бактерий. Под микроскопом они выглядят как большие тёмные скопления, представляют собой аморфные образования. Если синтез белка прекращается, то тельца включения постепенно исчезают и полностью свёрнутый белок появляется в цитоплазме.

При выделении рекомбинантных белков основным преимуществом телец включения является то, что они содержат относительно чистый экспрессируемый белок и сравнительно легко выделяются; стабильность (недоступность для протеаз), простота очистки и низкое содержание примесей. Однако недостаток – это последующий рефолдинг (повторное сворачивание) белка. Поэтому существуют специальные системы экспрессии, намеренно направляющие белок в тельца включения.

19. Какими растворами промывают “тельца включения” для подготовки к очистке? Для чего используется каждый этап промывки?

1. Разрушают клетки ультразвуком в буфере 20 мМ р-ре Трис-HCl, рН 7.0. Этот буфер используется для перехода содержимого в экстракт.

2. К разрушенным клеткам добавляют 0.9% NaCl. Он служит для удаления гидрофильных примесей.

3. Промывка Triton 1% X-100 – служит для удаления гидрофобных компонентов (клеточных мембран в основном)

4. Промывка буфером 20 мМ Трис-HCl pH 7.0 – для промывки телец включений от детергента;

После каждого этапа необходимо ресуспендировать образцы и после центрифугировать-осадить белок. После центрифугирования сливается супернатант (надосадочная жидкость).

5. К осадку добавляют мочевину, чтобы перевести тельца-включения в раствор. На этом этапе белок готов для очистки на хроматографической колонке.