- •Что такое генетическая трансформация? Какие способы трансформации бактериальных клеток существуют?
- •Какими свойствами обладают компетентные клетки и для чего они используются?
- •Опишите структуру экспрессионной плазмиды. За какие функции отвечает каждый из ее участков?
- •Что такое бактериальный оперон? Опишите структуру и принцип работы арабинозного оперона.
- •Что такое селективный скрининг? Для чего его применяют?
- •Для чего добавляют антибиотик и арабинозу в агар для выращивания клеток, трансформированных плазмидой pGlo? Какие признаки мы можем наблюдать при таком выращивании?
- •Как рассчитать эффективность трансформации? От чего она зависит?
- •Какие организмы используются в биотехнологии в качестве клеток-хозяев для биосинтеза белка?
- •Что такое рекомбинантные белки и как их получают?
- •Какими свойствами должен обладать экспрессионный бактериальный штамм для успешной экспрессии генов белков?
- •Какие вещества и в каких случаях используют для регуляции экспрессии гена целевого белка в бактериальных экспрессионных системах?
- •Для чего нужна регуляция экспрессии гена и каким образом она осуществляется?
- •Что такое иптг? Что происходит в трансформированных клетках после его добавления в питательную среду?
- •В каких отделах клетки и в какой форме может осуществляться накопление белка при экспрессии гена?
- •Ген экспрессируемого в е.Coli белка находится под промотором рнк полимеразы фага т7. Какие гены должны присутствовать в клетке-хозяине, чтобы экспрессия была эффективной?
- •В каких условиях производится культивирование трансформированных клеток е.Coli bl21?
- •Какие преимущества и недостатки получения целевого белка в растворимой форме при экспрессии его гена в бактериальной культуре?
- •Что такое “тельца включения”? Какие преимущества и недостатки они дают при выделении рекомбинантных белков?
- •Какими растворами промывают “тельца включения” для подготовки к очистке? Для чего используется каждый этап промывки?
- •Какие методы используют для разрушения бактериальных клеток?
- •Какие существуют виды хроматографии по механизму разделения веществ? Каковы особенности каждого вида?
- •Как происходит разделение веществ при ионообменной и аффинной хроматографиях?
- •Какие вещества мешают определению концентрации белка колориметрическими методами и каким образом можно от них избавиться?
- •Опишите принцип определения концентрации белка по Лоури.
- •Какими способами осуществляют денатурацию белков при проведении электрофореза?
- •Какие подложки используют для проведения электрофореза и какие преимущества и недостатки они имеют?
- •Что такое полиакриламидный гель? Как он формируется?
- •Из каких участков состоит пааг для разделения белков и для чего служит каждый из них?
- •Для чего в состав пааг и разделяемых образцов вводят дсн?
- •Какими методами осуществляют визуализацию разделенных с помощью электрофореза молекул?
Какие подложки используют для проведения электрофореза и какие преимущества и недостатки они имеют?
Используют твердые подложки.
Подложка |
+ |
- |
Фильтровальная или хроматографическая бумага |
Сниженная конвекция разделенные зоны фиксируются и красятся; Оборудование проще |
Непрозрачность; Загрязнения и неоднородность бумаги мешают разделению ; “Хвосты” из-за высокой адсорбционной емкости.; Фон окрашивается(затрудняет распознавание |
Пленки из ацетата целлюлозы |
Быстрый, требует меньшего количества пробы для анализа. Низкая адсорбционная емкость помогает избежать появления “хвостов” на электрофореграмме. После окрашивания фон остается бесцветным. |
Непрозрачность в водных растворах (можно добиться прозрачности, погрузив в минеральное масло). Дороже, чем при использовании бумаги. Мало пригоден для препаративного электрофореза. |
Крахмальный гель |
первый носитель со свойствами молекулярного сита. Активно препятствует конвекции. Повышает разрешение. |
Низкая прозрачность, хрупкость, размер пор можно менять лишь в небольших пределах. Приготовление качественного геля трудоемко |
Агарозный гель |
Удовлетворительная прозрачность, высокая пластичность (проще резать, удобнее красить и определять ферментативную активность прямо в геле), простота изготовления |
Из-за отрицательного заряда на сульфатных и СООН-группах сетки агара возникает электроосмос, приводящий к неравномерному распределению электрического поля, а иногда – гидростатического давления. Возможно химическое взаимодействие веществ с агаром |
Полиакриламидый гель |
Химически инертен, можно кипятить. Можно задать необходимый размер пор и обеспечить свойства молекулярного сита. Высокая прозрачность. Легко готовить. Упругий, прочный |
На сегодняшний день наилучший носитель, но готовится из акриламида - ядовитого вещества. Так же можно сказать, что помимо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов |
Что такое полиакриламидный гель? Как он формируется?
ПААГ формируют путем сополимеризации акриламида (создающего линейную “основу”) и метиленбисакриламида (служащего для поперечных “сшивок” линейных цепей).
Процесс полимеризации инициируется персульфатом, (можно применять другие инициаторы, напр., рибофлавин и свет) и катализируется тетраметилэтилендиамином (TEMED).
В результате полимеризации получаются гели ячеистой структуры, размеры пор в которых зависят от концентрации мономеров. Каждый второй углеродный атом линейной цепи содержит кислотную амидную группу, что обеспечивает гидрофильность полимера.
Из каких участков состоит пааг для разделения белков и для чего служит каждый из них?
Гель должен состоять из агарозной пробки, разделяющего геля, концентрирующего геля и лунок.
Пробка - нужна для образования стоп-линии.
Разделяющий – нижний мелкопористый гель. В нем происходит электрофоретическое и молекулярно-ситовое разделение компонентов пробы.
Концентрирующий – крупнопористый гель. Размер пор ограничивает диффузию. Нужен для электрохимического концентрирования белков (собирает смесь белков перед переходом в разделяющий гель в одну узкую полоску).
Лунки – в них заливается образец.