- •Иммунология : практикум : учеб. Пособие / [Ковальчук л. В. И др.] - 2010. - 176 с. : ил.
- •1.1. Инбредные животные
- •1.2. Линии мышей с генетическими дефектами, затрагивающими иммунную
- •1.3. Линии мышей с аутоиммунной
- •1.4. Биологические материалы
- •1.5. Методические особенности работы
- •Глава 2 Методы разделения клеток периферической крови человека
- •2.1. Выделение лейкоцитов
- •2.2. Выделение мононуклеарных клеток
- •2.3. Выделение моноцитов
- •2.4. Выделение нейтрофилов
- •2.5. Аналитическая и препаративная цитофлуориметрия
- •2.6. Иммуномагнитная сепарация клеток
- •Глава 3. Методы изучения функциональной активности клеток иммунной системы in vitro и in vivo
- •3.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов
- •3.2. Оценка клеточной цитотоксичности
- •3.3. Оценка функциональной активности
- •Глава 4 Иммуноанализы
- •4.1. Методы определения преципитатов антител с антигенами в геле
- •4.2. Иммуноферментный и радиоиммунный
- •4.3. Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность тест-систем иммуноанализов
- •4.4. Определение количества клеток, секретирующих тот или иной продукт, - метод elispot
- •4.5. Методы исследования внутриклеточных цитоплазматических и ядерных белков - факторов транскрипции, сигнальных молекул и других
- •Глава 5
- •Глава 6. Генетическая методы исследования в иммунологии.
- •6.1. Полимеразная цепная реакция
- •6.2. Исследование экспрессии генов методом микрочипов
- •6.3. Получение мышей с нокаутом
- •6.4. Применение регуляторных микро-рнк в иммунологических исследованиях
- •Глава 7
- •I. Оценка клеток-продуцентов.
- •II. Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма.
- •III. Оценка клеток-мишеней.
6.2. Исследование экспрессии генов методом микрочипов
Биологические микрочипы - один из новейших инструментов биологии и медицины.
Прообразом современных микрочипов стал саузерн-блоттинг, изготовленный в 1975 г. Эдом Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфической последова-
тельности среди фрагментов ДНК, зафиксированных на твердой подложке.
Точнее всего биочипы описывает английское название «DNAmicroarrays», что означает «организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе-платформе». В качестве платформы используют пластинку из стекла, иногда и другие материалы, например кремний, различные гели. На платформу наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.
В зависимости от того, какие макромолекулы используются и каковы цели исследования, выделяют различные виды биочипов: ДНК-микрочипы и белковые микрочипы. Опишем методику с применением ДНК-микрочипов.
|
Размещенные на платформе макромолекулы занимают очень небольшой участок - размером с покровное стекло (рис. 6.8, см. также цв. вклейку). Микроскопический размер биочипа позволяет размещать на небольшой площади огромное количество разных молекул ДНК и считывать с этой площади информацию с помощью специального лазерного устройства.
Рис. 6.8. Стекла, используемые для приготовления микрочипов
В поверхностных матричных биочипах ДНК иммобилизуется на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника или металла. В гелевых биочипах ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10-20 мкм, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла. Иммобилизуемая ДНК наносится на поверхность или через игольчатые растры механического робота, или с помощью технологии струйного принтера (рис. 6.9, см. также цв. вклейку). Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения. Затем на биочипе гибридизуют молекулы ДНК, меченные с помощью флюоресцентной или радиоактивной
метки (рис. 6.10, см. также цв. вклейку). Интенсивность флюоресценции в ячейках измеряют с помощью сканера, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью (рис. 6.9, см. также цв. вклейку). Данные о гибридизации получают также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др. В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизованной ДНК лежит точное соответствие между комплементарными ДНК (по правилу Уотсона-Крика): А-Т, G-С. Если соответствие между нуклеотидами иммобилизованной и гибридизуемой ДНК полностью отвечает условиям комплементарности, то образующиеся дуплексы будут термодинамически наиболее устойчивы и станут давать более сильный сигнал флюоресценции. Выявление и сопоставление наиболее ярко светящихся ячеек проводит прибор - анализатор биочипов.
|
Рис. 6.9. Оборудование для приготовления микрочипов: механический робот для нанесения через игольчатые растры проб на поверхность стекол (а); сканер для детекции интенсивности флюоресценции в ячейках (б); данные со сканера передаются на персональный компьютер для дальнейшей обработки
Гибридизуемая ДНК обычно заранее вырабатывается в достаточных количествах с помощью ПЦР. При использовании более современных технологий ПЦР осуществляется непосредственно на чипе. Анализ на 1 микрочипе занимает 6-10 ч и позволяет провести диагностику индивидуально.
Рис. 6.10. Схема гибридизации меченой пробы с микрочипом: а - исходная поверхность микрочипа; б - добавление меченой пробы; в - гибридизация микрочипа с пробой в течение 16 ч; г - отмывка микрочипа от несвязавшейся пробы; д - детекция результатов
С помощью микрочипов возможны:
• одновременный анализ работы десятков тысяч генов, сравнение их экспрессии;
• быстрое определение наличия вирусных и бактериальных возбудителей;
• диагностика лейкозов и других вирусных заболеваний;
• диагностика различных видов раковых опухолей;
• скрининг действия новых лекарств на различные гены (такие исследования помогают создавать новые лекарственные препараты, выяснять, на какие гены и каким образом эти препараты действуют).
Еше биочипы - незаменимый инструмент для биологических исследований: в процессе одного эксперимента нередко выясняется влияние различных факторов на работу десятков тысяч генов.