- •Иммунология : практикум : учеб. Пособие / [Ковальчук л. В. И др.] - 2010. - 176 с. : ил.
- •1.1. Инбредные животные
- •1.2. Линии мышей с генетическими дефектами, затрагивающими иммунную
- •1.3. Линии мышей с аутоиммунной
- •1.4. Биологические материалы
- •1.5. Методические особенности работы
- •Глава 2 Методы разделения клеток периферической крови человека
- •2.1. Выделение лейкоцитов
- •2.2. Выделение мононуклеарных клеток
- •2.3. Выделение моноцитов
- •2.4. Выделение нейтрофилов
- •2.5. Аналитическая и препаративная цитофлуориметрия
- •2.6. Иммуномагнитная сепарация клеток
- •Глава 3. Методы изучения функциональной активности клеток иммунной системы in vitro и in vivo
- •3.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов
- •3.2. Оценка клеточной цитотоксичности
- •3.3. Оценка функциональной активности
- •Глава 4 Иммуноанализы
- •4.1. Методы определения преципитатов антител с антигенами в геле
- •4.2. Иммуноферментный и радиоиммунный
- •4.3. Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность тест-систем иммуноанализов
- •4.4. Определение количества клеток, секретирующих тот или иной продукт, - метод elispot
- •4.5. Методы исследования внутриклеточных цитоплазматических и ядерных белков - факторов транскрипции, сигнальных молекул и других
- •Глава 5
- •Глава 6. Генетическая методы исследования в иммунологии.
- •6.1. Полимеразная цепная реакция
- •6.2. Исследование экспрессии генов методом микрочипов
- •6.3. Получение мышей с нокаутом
- •6.4. Применение регуляторных микро-рнк в иммунологических исследованиях
- •Глава 7
- •I. Оценка клеток-продуцентов.
- •II. Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма.
- •III. Оценка клеток-мишеней.
2.3. Выделение моноцитов
Лабораторные методы выделения моноцитов разнообразны, но основные методические приемы преимущественно связаны с фракционированием моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластиковой поверхности или по способности при центрифугировании к локализации в определенных зонах ступенчатого градиента.
Выделение моноцитов по способности прилипать к стеклу или пластику
Принцип метода. Моноциты периферической крови человека получают выделением мононуклеарных клеток по методу Воуит с последующим их фракционированием на прилипающие (ПК) и неприлипающие клетки (НПК). Для получения моноцитов мононуклеарные клетки, выделенные в одноступенчатом градиенте фиколлурографина, разделяют на ПК и НПК, используя способность клеток моноцитарно-макрофагального ряда прилипать к стеклу и пластику. Для этого суспензию мононуклеаров в концентрации 2χ106 кл/мл культивируют в среде 199, содержащей 20% сыворотку эмбриона коровы (СЭК), при 37 °С в пластиковых чашках Петри. Через 40 мин собирают НПК, а ПК снимают со дна чашки охлажденным (4-6 °С) раствором Версена, который заливают по 1 мл в чашку сразу после удаления надосадочной жидкости. Через 1-2 мин собирают ПК, помещают в силиконированные центрифужные пробирки и центрифугируют при 200 g в течение 10 мин. Удаляют надосадочную жидкость и ПК ресуспендируют в среде 199 с 10% СЭК.
Метод Рекалде
Принцип метода. Данный метод выделения моноцитов основан на центрифугировании лейкоцитов в гипертоническом градиенте плотности фиколл-урографина (Recalde Н., 1984).
|
Лабораторная работа 2-2
Постановка метода Рекалде
1. Кровь осторожно перемешивают с 6% раствором декстрана Т-500 («Pharmacia», Швеция), приготовленном на физиологическом растворе из расчета: 1 объем декстрана на 5 объемов крови.
2. Кровь отстаивается в течение 30 мин (15 мин при 37 °С, затем 15 мин при комнатной температуре).
3. Осторожно собирают плазму, обогащенную лейкоцитами (лейкомасса). К полученной лейкомассе трехкратно добавляют раствор NaС1 по следующей схеме:
• 0 мин - добавляют 9% NaС1 из расчета 5 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С;
• 11-я минута - добавляют 9% NaС1 из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37° С;
• 21-я минута - добавляют 9% ?С1 из расчета 10 мкл на 1 мл лейкомассы, инкубация 10 мин при 37 °С.
Общее время инкубации составляет 30 мин.
4. К лейкомассе добавляют равный объем раствора Хенкса, соответствующей осмомолярности, полученный путем добавления 25 мкл 9% раствора NaС1 на каждый миллилитр стандартного раствора Хенкса.
5. Немедленно проводят выделение моноцитов на гипертоническом градиенте плотности. Для этого в стандартный раствор фиколлурографина добавляют кристаллический NaС1 из расчета 2,8 мг на каждый миллилитр раствора фиколл-урографина (удельная плотность 1,078 г/см3). Конечная плотность раствора составляет 1,080 г/см3. В силиконированные пробирки на один объем гипертонического градиента осторожно наслаивают 3 объема подготовленной лейкомассы.
6. Пробирки центрифугируют в течение 25 мин при 400 g при комнатной температуре в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования моноциты концентрируются в интерфазном кольце.
7. Моноциты из интерфазы переносят в силиконированные пробирки и дважды отмывают средой 199, содержащей 5% СЭК. Режим центрифугирования - 10 мин при 200 g.
|
8. Клетки ресуспендируют в питательной среде RPMI-1640, содержащей 1% L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина и 10% СЭК. Количество моноцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивают с помощью 0,1% раствора трипанового синего.