диссертации / 56

31

стероидов. Так, различают РЭ и [77, 130] ПР – А и В [46, 74]. Отдельные участки рецепторной молекулы способны взаимодействовать с репортерным геном и индуцировать его транскрипцию [8]. Поэтому такие участки получили название транскрипционные активационные функциональные единицы (TAF или AF). AF-1 находится на N-конце рецептора прогестерона, AF-2 локализован на С-конце [107]. AF-3 обнаружен только у В-изоформы рецептора прогестерона в дополнительной аминокислотной последовательности N-конца [126].

Особенность AF-3 заключается в относительной автономности его активности – он самостоятельно работает как транскрипционный активатор или проявляет функциональный синергизм с AF-1 и AF-2. В некоторых клеточных и промоторных контекстах AF-1 и AF-2 могут функционировать независимо, но в большинстве случаев для полного транскрипционного ответа необходим функциональный синергизм обоих активационных участков [34]. После присоединения лиганда-агониста молекула стероидного рецептора претерпевает внутримолекулярное связывание AF-1 и AF-2 [139].

Когда в качестве лиганда выступает антагонист (мифепристон),

взаимодействия двух функциональных доменов рецепторной молекулы между собой не происходит [7, 21].

Именно прямое взаимодействие AF-1 и AF-2 определяет полную активацию гормон-рецепторного комплекса. Указанный процесс протекает более интенсивно в ПР-В (за счет дополнительной аминокислотной последовательности) по сравнению с ПР-А, что по-видимому отражает значительно больший активационный транскрипторный потенциал ПР-В по сравнению с ПР-А [139].

РЭ и РП принадлежат к суперсемейству ядерных рецепторов NR. К

этому суперсемейству помимо стероидных, тиреоидных и рецепторов витамина Д, относятся рецепторы ретиноидной кислоты ( , , и κάππα ),

32

рецептор пролифератора пероксисом (PPARS) и целый ряд так называемых рецепторов-сирот (орфан-), лиганды для которых пока не идентифицированы

[45, 63].

Линейное строение рецепторных молекул NR вне зависимости от их размеров стандартно включает в себя, по меньшей мере, четыре дискретных структурно-функциональных фрагмента (домена) – А/В, С, D, E. В

некоторых случаях выявляется пятый фрагмент – домен F. Наиболее функционально значимыми и абсолютно необходимыми являются домены Е и С [9]. Рецепторы стероидов способны образовывать в среде с низкой ионной силой крупномолекулярные гетеромеры 8-9S формы [122]. Вне связи с лигандом рецептор прямо или опосредованно связан с различными вспомогательными белками (в настоящее время известно 8 таких белков)

[122]. Hsp 90 – наиболее постоянный компонент белкового комплекса. Семь других белков это – hsp70, р60, р23, три больших иммунофиллина (FK506, FKBP52 и FKBP54) и циклоспорин А-связывающий протеин CyР40 [45, 81 121].Имеет место еще и трансцидентный компонент комплекса – протеин р48

[121, 122].

Белки теплового шока выполняют функцию шaперонов, способствуя правильному образованию надпервичных структур белковой молекулы после

(в процессе) синтеза и поддерживая рецептор в неактивном состоянии.

Связывание гормона с рецептором ведет к конформационным изменениям последнего [82]. Такая модификация вызывает каскад событий с последующим привлечением корегуляторов и активацией/репрессией транскрипции [68].

Взаимодействие стероида с рецептором вызывает димеризацию последнего. Впервые это было подтверждено in vivo [75] для рецептора прогестерона. Исходя из наличия двух форм рецептора прогестерона,

логично предположить существование трех вариантов димеров А:А, А:В и В:В. Относительная концентрация каждой димерной пары прямо

33

пропорциональна уровню экспрессии ПР-А и ПР-В. Активированный димер связывается с ДНК через ДНК-связывающие домены и вызывает генную транскрипцию [144].

Активный транспорт рецепторов в ядро зависит от наличия в молекуле рецептора так называемых ядерных локализационных сигналов (NLS),

являющихся короткими основными мотивами, богатыми аргинином и лизином. NLS узнается и связывается с NLS-связывающими протеинами,

которые располагаются в непосредственной близости с ядерными порами и имеют идентификационную последовательность для узнавания, связывания и транспорта ПР и РЭ в ядро [41, 75, 124].

Стероид-рецепторный димер взаимодействует со специфической ДНК в регуляторной области гена-мишени. Такой cis-элемент был назван ГЧЭ – гормон - чувствительный элемент. ГЧЭ представляет собой последовательность 15 основных пар нуклеотидов. Их структура палиндромна. Одна молекула рецептора связывается с половиной сайта.

Идентифицированы три класса ГЧЭ – прогестерон/глюкокортикоид чувствительный элемент, эстрадиол- и тиреоидответственные единицы.

Последовательность прогестерон - чувствительного элемента ДНК идентична андрогенному и минералокортикоидному элементам. Несмотря на это, для каждого специфического рецептора требуются свои особенные условия для связывания со своим отвечающим элементом [28].

ГЧЭ с высоким сродством (Касс 10 8-11 моль/л) способны связывать гормон - рецепторные комплексы [42]. Универсальные минимальные структуры в составе ГЧЭ – консенсус последовательности - необходимы для узнавания гормон - рецепторных комплексов. Предполагают, что два сета минимальной структуры ГЧЭ обусловливают связывание гормон -

рецепторного комплекса в его димерной форме, причем каждый сет

34

связывает мономер; этим обеспечивается кооперативность транскрипционного эффекта.

Механизм, за счет которого взаимодействие рецептора с ДНК изменяет генную транскрипцию, до конца не выяснен. На первый план выходят белок-

белковые взаимодействия с основными транскрипционными факторами или с промежуточными коактиваторами. Полученный в результате комплекс инициирует или блокирует транскрипцию через РНК - полимеразу II [111].

Стероидные рецепторы прямо изменяют скорость транскрипции, влияя на стабильность преинициального комплекса.

Рецептор - активированная транскрипция находится под контролем различных кофакторов, которые усиливают или ослабляют эффект стероида

[35]. Обычно, белковые факторы, выделенные из клеток-мишеней,

взаимодействуют со стероидными рецепторами по лиганд - зависимому образу [71].

Избыточная экспрессия одного рецептора может ингибировать сигнал,

индуцированный другим рецептором, так же связывающимся с соответствующим ГЧЭ. Это так называемый эффект протеста (squelching effect). Например, оверэкспрессия РЭ подавляет стимулирующее действие прогестерона на ген-мишень [51].

Еще одним важным аспектом регуляции функции рецепторов является фосфорилирование. Посттранскрипционная модификация рецептора является одним из механизмов саморегуляции активности рецепторной функции.

Общий уровень фосфорилирования увеличивается во время лиганд-

зависимой активации клетки [116]. Рецептор прогестерона фосфорилируется по трем остаткам серина (211, 260 и 530). Серины 211 и 260 относятся к А/В

району, Серин 530 – к D-домену. Базальный уровень фосфорилирования серинов составляет 20, 20 и 2%, соответственно. При добавлении прогестерона он возрастает до 35, 35 и 35%. Указанное фосфорилирование не

35

является необходимым для процессов связывания, активации и даун -

регуляции РП, однако заметно модулирует активность рецепторной молекулы.

Вопрос о механизмах терминации рецепторного цикла остается дискутабельным. Одним из механизмов обратимой терминации рецепторного цикла может быть инактивация рецептора с помощью дефосфорилирования.

Фосфорилирование белка быстро восстанавливает его гормон-

связывающую активность и рециклизирует тем самым рецептор.

Необратимая инактивация рецепторных белков осуществляется в результате их протеолиза по убикитин-протеосомному пути [102].

В конце 70-х и начале 80-х были охарактеризованы 2 изоформы рецептора прогестерона [74, 83]. Тонкие эксперименты позволили оценить физиологическое значение А- и В-типов РП [40]. Так, у животных, лишенных РП-А, (PRACO) на фоне нарушенной функции яичников и матки

(некомпенсированная прогестероном пролиферация клеток), практически не страдают молочные железы и тимус. И, наоборот, у PRBCO-мышей (без РП-

В) фертильность не нарушена (успешная беременность с нормальным количеством плодов) и, по мнению авторов, одних лишь рецепторов прогестерона-А достаточно, чтобы противостоять эстроген-индуцированной пролиферации тканей матки. Тип РП принципиально важен для развития и морфогенеза молочных желез, здесь доминирует РП-В [47].

РП-В имеет молекулярную массу 110-120 кДа и дополнительные 164

аминокислотные остатка на N-конце. ПР-А – 72-86 кДа. Обе изоформы кодируются единственным геном, но регулируются различными промоторами. У крыс и людей изоформы ПР имеют различные мРНК, тогда как у цыплят – они являются продуктами альтернативного процессинга мРНК [46, 74].

36

Функциональные свойства изоформ рецептора прогестерона достаточно хорошо изучены в транскрипционных системах in vitro [130].

Несмотря на схожий аффинитет различных агонистов и антагонистов к изоформам РП, они реализуют различные функции: РП-В действует как транскрипционный активатор генов (например, вируса опухоли молочной железы, гена тирозинаминотрансферазы и тимидинкиназы) в различных клетках. РП-А – не активирует транскрипцию, a чаще действует как строгий репрессор транскрипционной активности, опосредуемой через РП-В и другие стероидные рецепторы (эстрогенов, глюкокортикоидов,

минералокортикоидов и андрогенов) [129].

Различия в транскрипционной активности диктуются различиями в строении молекул отдельных изоформ РП. Рецептор имеет 3 активационно-

функциональные единицы (фактора) – AF-1, 2 и 3 (рис.1.4).

Рисунок.1.4 Структурная организация изоформ ядерных рецепторов прогестерона [65].

ПР-А

IF AF-1DBD AF-2LBD

ПР-В

AF-3 IF AF-1 DBDAF-2LBD

Первые два фактора представлены в обеих изоформах, тогда как AF-3

есть только в ПР-В [66]. Более того, обнаруженный вблизи AF-1

37

ингибиторный фактор (IF), активен только в ПР-А. Это связано с тем, что IF

ингибирует AF-1 и AF-2, но не AF-3, присутствующий исключительно в ПР-

В [84]. Гомодимеры ПР-В проявляют большую связывающую способность к ДНК-последовательности, тогда как гетеродимеры А/В являются менее стабильными и менее эффективно связываются с ДНК [97].

Очевидно, что существует сложная коммуникационная сеть рецепторов стероидных гормонов и других путей сигнальной передачи. Стероиды регулируют систему вторичных посредников, которые, в свою очередь,

регулируют транскрипционную активность стероидных рецепторов.

Например, фосфорилирование может обеспечивать или препятствовать связыванию рецептора с ДНК. Прогестерон вызывает фосфорилирование Ser

294, медиируемое митоген активируемыми протеинкиназами (MAРKs).

Такое фосфорилирование является сигналом для деградации рецепторной молекулы по убикитин-зависимому пути и включению в 26S-протеосомы.

Следовательно, другой функцией фосфорилирования является проведение сигнала негативной регуляции прогестероном своего рецептора и медиируется MAРKs [65, 94].

Изоформы ПР имеют разную тканевую локализацию. Синтез изоформ РП регулируются разными эстроген-индуцированными промоторами. По-

видимому, такое разнообразие путей проведения гестагенового сигнала в организме обеспечивает весь спектр биологической активности прогестерона. Направленный поиск лекарственных препаратов селективного действия необходим для дифференциальной фармакологической коррекции состояний, в патогенезе развития которых предоминирует одна из изоформ рецептора прогестерона (неоплазии, патологии ЦНС и др.).

38

1.4.2 Женские половые гормоны и иммунитет.

Вопрос взаимосвязи иммунологических факторов и беременности остается актуальным для выяснения причин неуспеха ЭКО [24, 64].

Женские половые стероидные гормоны участвуют в нормализации иммунного ответа на всех стадиях беременности. Под влиянием прогестерона активируются лимфоциты и начинают вырабатывать белок – прогестерониндуцированный блокирующий фактор (ПИБФ), который оказывает антиабортивное действие и способствует сохранению беременности [64, 70]. Этот фактор вырабатывается CD56+ -клетками,

находящимися на фетоплацентарной поверхности мембраны.

Влияние ПИБФ отражается как на клеточных, так и на гуморальных иммунных механизмах. ПИБФ на клеточном уровне оказывает влияние на синтез цитокинов в лимфоцитах Т-хелперов. Прогестерон и релаксин стимулируют синтез ПП14 в эндометрии [135].

In vivo аллоантигенная и митогенная стимуляция вызывает увеличение уровня рецепторов прогестерона в лимфоцитах. Считается, что увеличение числа рецепторов прогестерона в этих клетках при беременности может быть связано с присутствием зародыша, который выступает в роли аллоантигенного стимулятора [123].

При нормально протекающей беременности происходит сдвиг в сторону увеличения Тх2 и продукции ими цитокинов при одновременном снижении Тх1. Этот механизм способствует сохранению беременности.

В присутствии ПИБФ в активированных лимфоцитах вырабатывается в

8 раз больше цитокина Тх2 (ИЛ-2), чем в его отсутствие. Увеличение продукции цитокинов Тх2 влечет за собой повышение выработки иммуноглобулинов. При введении ПИБФ животным было отмечено появление новой подгруппы иммуноглобулинов – асимметричных антител.

39

Эти антитела способны связываться с антигенами, конкурировать с антителами той же специфичности и выступать в качестве «блокирующих» антител [20]. ПИБФ появляется в крови женщин с ранних сроков беременности, его концентрация нарастает, достигая максимума к 40 неделям беременности. Содержание ПИБФ резко падает после родов. При невынашивании беременности и вне беременности определяют низкие уровни ПИБФ в крови.

Прогестерон – мощный ингибитор синтеза LIF, а эстрадиол – его стимулятор. Эстроген в плазме крови отражает уровень фолликулярного ИЛ- 1β и коррелирует с эффективностью трансфера эмбриона в программе ЭКО

[101].

Мифепристон (антигестаген) повышает продукцию провоспалительных агентов – ИЛ-8, моноцит - хемотаксического пептида (MCP-1),

циклооксигеназы-2 [7, 82].

Эстрогены стимулируют миграцию лейкоцитов в эндометрий, в

основном за счет натуральных киллеров и макрофагов. Количество Т-клеток в эндометрии не зависит от уровня эстрадиола. При этом не меняется экспрессия хемокинов M-CSF и MCP-1, и уменьшается – ИЛ-8 в железах

[29].

Кроме того, прогестерон стимулирует экспрессию α1β1 интегрина в эндометрии [99] а Е2 ингибирует синтез β3 субъединицы интегрина αv β3 в

строме [86] .

1.5 Заключение.

Очевидно, что строго координированный гормональный контроль функции как эндометрия, так и иммунокомпетентных клеток является абсолютно необходимым условием успешной имплантации. В свою очередь,

способность клеток адекватно отвечать на гормональный сигнал зависит от

40

представленности соответствующих рецепторов в клетках-мишенях. В

литературе имеются скудные данные о рецепции женских половых стероидов в эндометрии и отдельных фракциях клеток белой крови при имплантации

[29]. При этом представленные данные весьма противоречивы и носят преимущественно качественный характер. Следовательно, изучение рецепторного статуса клеток мононуклеарной фракции крови, а так же эндометрия, необходимо для выяснения тонких механизмов контроля имплантации и ее нарушения при разных вариантах женского бесплодия.

Такое исследование позволит выявить дополнительные предикторы эффективности программы ЭКО, в то время как поиск способа персонализации гестагенной поддержки первого триместра, поможет снизить риск самопроизвольных выкидышей и сохранить долгожданную беременность.