диссертации / 56

41

Глава 2. Материалы и методы.

2.1.Характеристика клинического материала.

Висследование вошли 50 женщин от 26 до 39 лет, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения. Все пациентки наблюдались на базе отделения ЭКО (зав. Отделением ЭКО КДО – врач высшей категории Лебедева Е.Г.) Центра Планирования и Репродукции Семьи (главный врач центра – главный акушер – гинеколог г. Москвы, д.м.н. профессор, чл. –

корр. РАМН Курцер М.А.). Условиями включения в исследование явилось отсутствие у пациенток тяжелой соматической патологии и выраженных метаболических нарушений, а также бесплодный брак.

Пациенток ретроспективно разделили на 2 группы в зависимости от результатов лечения: в I группу вошли 28 пациенток с наступившей беременностью, во II – 22 пациентки с безуспешной попыткой ЭКО и ПЭ.

Дальнейший анализ результатов проведенных исследований проводился по группам.

I группа (пациентки с наступившей беременностью).

Возраст пациенток I группы составил 26-38 лет, средний возраст –

32,8±3,5, года медиана – 33,5 года. Индекс массы тела (ИМТ) или индекс Кетле большинства пациенток был менее 26 кг/м2, лишь у 3-х пациенток

(11%) ИМТ находился в пределах 26-30 кг/м2. Менархе у всех паценток установилось своевременно – с 11 до 14 лет, в среднем в 12,4±0,2 лет.

Длительность менструального цикла составила от 27 до 33 дней, в среднем –

28,6±1,2 дней, длительность менструации от 4 до 7 дней, в среднем – 5,4±0,9

дней. У всех пациенток отмечался регулярный менструальный цикл,

отклонений гормональных показателей от нормы не выявлено. У 7 женщин I

группы (25%) бесплодие было первичное, вторичное бесплодие встречалось у 21 пациентки (75%).

42

В репродуктивном анамнезе 3-х пациенток (10,7%) беременности в данном браке уже завершались родами. В 2-х случаях беременности наступили самопроизвольно и завершились срочными родами и рождением доношенных здоровых детей. В 1-м случае беременность наступила после 3-

й попытки ЭКО и ПЭ и преждевременные роды произошли путѐм экстренного кесарева сечения, ребѐнок родился недоношенным и в последствии страдал детским церебральным параличом. У 8 (28,6%)

пациенток данной группы в анамнезе был искусственный аборт. У 6 женщин

(21,6%) в анамнезе был самопроизвольный выкидыш, у одной пациентки это произошло дважды. У 7 пациенток (25%) в анамнезе были внематочные беременности, у 2-х из них – два раза.

Длительность бесплодия варьировала в диапазоне от 1 до 19 лет.

Оперативные вмешательства по поводу трубно-перитонеального бесплодия

(в 16 случаях) или наружного генитального эндометриоза (в 7-ми случаях)

перенесли большинство пациенток – 19-ти из 28 пациенток (68%). У 18

пациенток (64%) – трубно-перитонеальный фактор, причем у 13 пациенток

(46%) он был единственной причиной бесплодия. Абсолютный трубный фактор, т.е. отсутствие обеих маточных труб встречался у 7 пациенток (25%)

данной группы. У 6 пациенток I группы (21%) бесплодие было связано с мужским фактором, из них у 3-х данный тип сочетался с трубным фактором или эндометриозом в анамнезе. У 6 пациенток (21%) были выявлены два или более факторов бесплодия. У 7 пациенток (25%) был наружный генитальный эндометриоз I-III стадии в анамнезе, являющийся единственным фактором бесплодия. У 4-х пациенток (14%) бесплодие было неясного генеза. 5

пациенток (18%) находились в позднем репродуктивном возрасте, т.е. от 37

до 39 лет. 16 пациенток (57%) вступали в 1-ую попытку ЭКО, 7 (25%) – во 2-

ую, 3 (10,7%) – в 3-ю, 1 (3,65%) – в 4-ю и 1 (3,65%) – в 5-ю.

При УЗИ органов малого таза у большинства пациенток не было выявлено патологии яичников и матки. У 2-х пациенток (7%) были признаки

43

аденомиоза и хронического эндометрита. У 1-й пациентки по данным УЗИ была диагностирована миома матки с интерcтициально-субсерозным расположением единственного узла диаметром 25 мм. У 4-х пациенток

(14%) был снижен овариальный резерв яичников – количество антральных фолликулов в каждом было менее 5, что предполагало бедный ответ на стимуляцию суперовуляции.

II группа (пациентки с не наступившей беременностью).

Возраст пациенток II группы составил от 27 до 39 лет, средний – 34,3±3,3

года, медиана – 35,5 лет. ИМТ или индекс Кетле большинства пациенток был до 26 кг/м2, лишь у 3-х пациенток (14%) ИМТ был в пределах 26-30

кг/м2. ИМТ в среднем составил 24,1±0,86 кг/м2. Менархе у всех установилось своевременно: с 12-14 лет, в среднем в 12,2±0,3 лет. Длительность менструального цикла составила от 26 до 35 дней, в среднем – 28,6±2 дней,

длительность менструации от 4 до 7 дней, в среднем – 5,5±0,8 дней. У всех пациенток отмечался регулярный менструальный цикл, отклонений гормональных показателей от нормы не было выявлено. Также не было выявлено клинических признаков гиперандрогении.

У 7 женщин II группы (31,8%) бесплодие было первичное, вторичное бесплодие встречалось чаще – у 15 пациенток (68,2%).

В репродуктивном анамнезе 2-х пациенток (9%) естественные беременности уже завершались родами и рождением доношенных здоровых детей. У 6 пациенток (27%) данной группы в анамнезе был искусственный аборт. У 4 женщин (18%) в анамнезе был самопроизвольный выкидыш, у

одной пациентки это случилось дважды. У 5 пациенток (23%) в анамнезе были внематочные беременности, у 1-й из них – два раза.

Длительность бесплодия варьировала в диапазоне от 2 до 15 лет.

Оперативные вмешательства по поводу трубно-перитонеального бесплодия

44

(в 11 случаях) или наружного генитального эндометриоза (в 3-х случаях)

были произведены большинству пациенток – 14-ти из 22 (64%). У 14

пациенток (64%) – трубно-перитонеальный фактор, причем у 10 (45%) он был единственной причиной бесплодия. Абсолютный трубный фактор, т.е.

отсутствие обеих маточных труб как следствие двусторонней тубэктомии по причине трубных беременностей в анамнезе встречался у 4 пациенток (18%)

данной группы. У 5 пациенток II группы (23%) бесплодие было связано с мужским фактором из которых у 1-й (4,5%) мужской фактор сочетался с трубным фактором. У 2 пациенток (9%) были выявлены 2 фактора бесплодия. У 3 пациенток (14%) был наружный генитальный эндометриоз I- III стадии в анамнезе, являющийся единственным фактором бесплодия у 2-х

женщин. У 2-х пациенток (9%) бесплодие было неясного генеза. 6 пациенток

(27%) были позднего репродуктивного возраста, т.е. от 37 до 39 лет. 11

пациенток (50%) вступали в 1-ую попытку ЭКО, 5 (23%) – во 2-ую, 2 (9%) –

в 3-ю, 2 (9%) – в 4-ю, 1 (4,5%) – в 5-ю и 1 (4,5%) – в 6-ю.

При УЗИ органов малого таза у пациенток этой группы не было выявлено патологии яичников и матки. У 4-х пациенток (18%) был снижен овариальный резерв яичников – количество антральных фолликулов в каждом было менее 5, что предполагало бедный ответ на стимуляцию суперовуляции.

Анализ анамнестических данных всех исследованных пациенток без распределения их на группы по наличию имплантации показал, что возраст пациенток составил в среднем 33,08 ± 3,4 года. Большее количество женщин,

включенных в исследование, относится к позднему репродуктивному возрасту, тогда как к репродуктивному возрасту относятся - 44%

исследуемых.

Дальнейший анализ анамнестических данных показал, что пациентки также могут быть разделены на группы по фактору бесплодия, количеству

45

попыток ЭКО, наличию или отсутствию синдрома гиперстимуляции яичников и длительности бесплодия.

Таблица 2.1. Анализ частоты распределения пациенток по данным анамнеза (количество пациенток (%)).

тип	первичное	13 (26%)
бесплодия
	вторичное	37 (74%)
	трубный	28 (56%)
фактор	неясный	7 (14%)
бесплодия
	мужской	10(20%)
	сочетанный	5 (10%)
количество	одна	28 (56%)
попыток
	две и более	22 (44%)
синдром	есть	11 (22%)
гиперстимуляции
	нет	39 (78%)
яичников
длительность	До 2 лет	15 (30%)
бесплодия	более 2-х лет	35 (70%)

По представленным в таблице данным видно, что количество пациенток с первичным бесплодием - 13 (26%), тогда как с вторичным, при наличии в анамнезе одной или нескольких беременностей, закончившихся родами, абортом или внематочной беременностью, после чего беременность не наступала в течение двух и более лет - 37 (74%) пациенток.

Наиболее частой причиной бесплодия у всех пациенток, вступивших в программу ЭКО, оказалась непроходимость маточных труб (абсолютная или относительная) - 28 (56%) пациенток; у 10 пациенток (20%) бесплодие было

46

связано с мужским фактором; сочетанная форма у 5 пациенток (10%),

бесплодие неясного генеза - у 7 женщин (14%).

По количеству проведенных попыток ЭКО пациентки были разделены на 2 группы, к группе с одной попыткой относятся 28 (56%) исследуемых, а к группе с двумя и более попытками - 22 (44%) женщин.

По наличию синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), пациентки были разделены на группу с СГЯ – 11 (22%) пациенток, и без СГЯ – 39 (78%)

женщин. В результате индивидуальной реакции пациенток на гиперстимуляцию ячников и возникновение побочного эффекта в виде СГЯ.

К группе с длительностью бесплодия до 2-х лет относятся 15 (30%)

исследуемых пациенток, а в группу с длительностью бесплодия более 2-х лет включены 35 (70%) женщин. 27 пациенток вступали в 1-ую попытку ЭКО, 12

– во 2-ую, 5 – в 3-ю, 3 – в 4-ю, 2 – в 5-ю и 1 – в 6-ю.

Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании.

2.2. Лабораторное оборудование и используемые химические

реактивы.

1)Лабораторное оборудование:

Центрифуга с охлаждением РС-6 (Россия)

Ультрацентрифуга UP-65M (Германия)

Жидкостной сцинтилляционный радиометр SL-30 Intertechnique

(Франция)

Спектрофотометр СФ-46 (Россия)

Микроразмельчитель тканей РТ-2 (Россия)

рН-метр Checker (США)

Проточный цитофлюориметр-сортер FACSAria (Becton Dickenson Co)

47

Стерильные пипетки на 5 мл

Эппендорфы стерильные на 1,5 и 0,2 мл

Пипетки на 1000, 200 и 10 мкл

Насадки для микропипеток на 1000, 200 и 10 мклс/без аэрозольного барьера

Вортекс microspin FV-2400 (BioSan, Латвия)

Микроцентрифуга eppendorf mini spin (Eppendorf, Германия)

Термостат Гном (ДНК-Технология, Россия)

Прибор iCycler iQ5 real-time PCR (BioRad, Германия)

Плоскодонные и круглодонные 96-луночные планшеты

(«Медполимер», Россия)

2)Химические реактивы:

ТЭД-буфер рН 7,4 (10 мМ трис-аминометан («Merck», Германия), 1,5 мМ ЭДТА («Sigma», США), 0,5 мМ дитиотрейотол («Calbiochem»,

Англия))

3Н-Р4 («Amersham», Англия)

3Н-Е2 («Amersham», Англия)

Прогестерон («Merck», Германия)

Диэтилстильбэстрол («Merck», Германия)

Гидрокортизон («Merck», Германия)

Дидрогестерон («Serva», Германия)

Активированный уголь (Norit А («Serva», Германия))

Сцинтилляционная жидкость: 0,2 мг РОРОР (1,4-бис-2-метил-5-

фенилоксизалилбензол, «Serva», Германия); 5 мг РРО (2,5-дифенилоксазол,

«Serva», Германия); 750 мл диоксана; 250 мл толуола

Стеклянные фильтры Whatman GF/B

48

Для проточной цитофлюориметрии: изотипические антитела

(«Becton Dickenson Co»); mous-a-human CD-3 FITS, mous-a-human CD-19 APS, mous-a-human CD-14 Pe-Cy5 («Becton Dickenson Co»), PBS - буфер

(«Becton Dickenson Co»), 2% р-р параформальдегида.

Раствор Хэнкса («ПанЭко», Россия)

Раствор Фиколла-урографина, ρ=1,077 г/см3 («ПанЭко», Россия)

Для ПЦР-РТ: реактивы "Реакционной смеси 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I" («Синтол», Россия)

Наборы реагентов для выделения мРНК «Рибо-преп» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия)

Получение кДНК на матрице мРНК «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия)

Праймеры для полимеразной цепной реакции («Синтол», Россия)

2.3.Методы исследования.

Все пациентки прошли клинические обследования в Центре Планирования Семьи и Репродукции, на базе отделения ЭКО, врач -

Клименко Мария Петровна, и были включены в программу экстракорпорального оплодотворения по стандартному длинному протоколу.

2.3.1 Клинические методы исследования

Анамнез:

Из анамнеза жизни пациенток особое внимание уделяли отягощѐнности преморбидного фона. Изучали:

А) возраст и состояние здоровья родителей при рождении пациентки,

особенности течения беременности и родов у матери, наличие у родственников эндокринно-обменных и онкологических заболеваний,

бесплодия и не вынашивания беременности;

49

Б) перенесенные в т.ч. инфекционные заболевания, наличие вредных привычек, резкого колебания массы тела, наличие хронических соматических заболеваний;

В) становление и регулярность менструаций, их длительность,

обильность и болезненность

Г) репродуктивная функция – уточняли характер бесплодия, при вторичном бесплодии уточняли количество беременностей, их количество,

хронология, исходы и осложнения

Д) гинекологические заболевания, перенесенные специфические инфекции, частота, длительность, методы и эффективность лечения.

Стандартные клинические методы исследования:

У обоих супругов определяли группу крови и резус-фактор, производили анализ крови на ВИЧ, RW, HBs и HCV.

Пациенткам также назначали общий анализ мочи, клинический и биохимический анализ крови, коагулограмма, определение антител к инфекциям TORCH-комплекса.

Исследовали мазки на флору из цервикального канала и влагалища, а

также проводили скрининговое исследование цитологических мазков из экто- и эндоцервикса. При выявлении кандидоза, бактериального вагиноза проводили предварительное лечение.

Инструментальные методы:

Из инструментальных методов всем пациенткам проводили флюорографию и электрокардиографию, а также скрининговое ультразвуковое исследование органов малого таза в первую фазу менструального цикла. УЗИ проводили при помощи УЗ-аппарата «Siemens»

50

(Германия) с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц

итрансабдоминального датчика с частотой 3,5 МГц.

Входе стимуляции овуляции проводили УЗ-мониторинг за ростом фолликулов и эндометрия.

УЗ диагностику наличия беременности осуществляли на 20-23-й день после ПЭ. При этом в полости матки выявляли одно или два плодных яйца, а

в яичниках – множество желтых тел, как следствие стимуляции суперовуляции. УЗ определение сердцебиения плода осуществляли при сроке беременности 6-7 акушерских недель.

На 20-22 день менструального цикла проводили пайпель-биопсию эндометрия (у 31 пациентки, т.е. у 62%, у остальных данная процедура оказалась технически невыполнимой). Материал сразу же замораживали для последующего определения РЭ и РП. В этот же день производили забор венозной крови из кубитальной вены с последующим определением уровня эстрадиола, прогестерона и уровня рецепторов на клетках МНФ

(контрольная точка). Дополнительно забор крови для определения уровня рецепторов на клетках МНФ осуществляли также в день забора яйцеклеток

(2-я точка определения) и в день трансфера эмбрионов в полость матки (3-я

точка определения).

Определение уровня гормонов в плазме крови.

На 2-4 дни менструального цикла в крови пациенток натощак определяли следующие гормональные показатели: ФСГ, ЛГ, эстрадиол, прогестерон,

ТТГ, пролактин, тестостерон. Определение концентрации ФСГ, ЛГ,

пролактина, тестостерона, прогестерона и эстрадиола проводили хемилюминесцентным методом с помощью автоматизированной аналитической системы ―Immulite 2000‖ производства фирмы «Siemens Healthcare Diagnostics Inc.» (США).