диссертации / 56

61

Рисунок 2.1. Пример кривых амплификации кДНК ( Gapdh, m-ER, PR-A).

Рисунок 2.2. Пример кривых плавления кДНК (Gapdh, m-ER, PR-A).

Используя метод РТ-ПЦР было выявлено, что прогестерон связывается со следующими типами рецепторов: PR-B, PGRMC1, m-PR, PR-A, а эстрадиол с

62

рецепторами: m-ER, ER-β, ER-α. Указанные типы рецепторов, представлены в

порядке убывания их активности.

2.4. Статистическая обработка результатов.

Обработка результатов проводили с использованием статистического пакета Statistics 6.0. и GraphPad Prism 5.

Для каждой из непрерывных величин приведены - среднее (М) и

стандартное отклонение (CD) или медиана и верхняя и нижняя квартили в зависимости от типа распределения исследуемой величины. Гипотеза о нормальном распределении изучаемого показателя проверялись с использованием критерия Колмогорова - Смирнова. При сравнении групп пациентов по основным показателям, полученным при включении в исследование, в зависимости от характера распределений использовались

U- критерий Манна-Уитни. Для статистического изучения связи между различными параметрами применялся непараметрический метод -

коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) [4].

63

Глава 3. Результаты собственных исследований.

Все обследованные нами пациентки были ретроспективно разделены на

2 группы в зависимости от исхода вспомогательной репродуктивной технологии: в I группу вошли 28 пациенток с положительным исходом, во II

– 22 пациентки с отсутствием имплантации в результате ЭКО и ПЭ.

Дальнейший анализ полученных результатов проводили по этим группам.

3.1. Концентрация рецепторов половых стероидов в цитозоле

эндометрия пациенток при первичном обследовании.

Действие любого гормона реализуется через рецепторный аппарат ткани – мишени. Эндометрий является основным органом – мишенью для половых стероидов. Поэтому для оценки готовности эндометрия к имплантации можно исследовать эндометрий на предмет содержания в нем цитозольных рецепторов половых стероидов: эстрадиола и прогестерона.

Результаты анализа рецепторного статуса эндометрия обследованных пациенток представлены в таблице 3.1.

Таблица 3.1. Описательная статистика значений уровня цитозольных рецепторов эстрадиола и прогестерона в эндометрии у всех пациенток,

включенных в программу ЭКО (фемтомоль/мг белка).

Показатель	Рецептор	Рецептор
	прогестерона	эстрадиола
минимум	0,0	0,0
25% перцентиль	0,0	0,0
медиана	0,9	1,2
75% перцентиль	224,0	24,7
максимум	506,0	110,0

64

среднее	110,7	17,5
Стандартное отклонение	170,8	30,8
Стандартная ошибка	41,4	7,4
Нижняя граница доверительного	22,9	1,7
интервала 95%
Верхняя граница доверительного	198,5	33,4
интервала 95%
Тест Колмогорова-Смирнова
P -значение	P<0,0001	P<0,0001
Нормальность распределения	нет	нет

Приведенные в таблице данные свидетельствуют о том, что закон распределения отличен от нормального. Поэтому в данном случае необходимо использовать непараметрические методы статистической обработки данных. По общему мнению большинства исследователей широкий разброс показателей свидетельствует об активной динамике рецепторов прогестерона и эстрадиола в эндометрии даже в пределах одной фазы менструального цикла [37].

3.1.1. Концентрация рецепторов половых стероидов в цитозоле

эндометрия пациенток при первичном обследовании в зависимости от

исхода программы ЭКО.

Из общего числа пациенток (50 человек) нами выделена группа,

состоящая из 31 женщины, у которых был получен биоптат эндометрия

(пайпель) на 21 – 23 день менструального цикла для определения уровня цитозольных РП и РЭ. Получение биоптата эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является причиной отказа пациенток от нее. Также не всем пациенткам удаѐтся произвести данную процедуру в связи со спазмом внутреннего зева, стенозом или особенностями направления хода цервикального канала.

65

Результаты анализа плотности рецепторов в цитозоле эндометрия обследованных пациенток в зависимости от исхода программы ЭКО представлены на диаграмме 3.1.

Диаграмма. 3.1. Уровень цитозольных рецепторов эстрадиола (РЭ) и

прогестерона (РП) в эндометрии пациенток, включенных в цикл ЭКО в зависимости от успеха имплантации до начала лечения.

фемтомоль/мг белка

180

160

140

120

100

80

60

40

20

0

РП РЭ

есть имплантация

нет имплантации

Анализ полученных данных показал, что у пациенток с успешной имплантацией уровень цитозольных рецепторов эстрадиола в ткани эндометрия до начала лечения был максимальным и равнялся 30,6 14,3

фемтомоль/мг белка цитозоля. У женщин с отсутствием имплантации средняя величина этого показателя была ниже и равнялась 9,3 9,3

фемтомоль/мг белка. Средняя концентрация рецепторов прогестерона в ткани эндометрия у пациенток с успешной имплантацией составляла

152,9 65,7 фемтомоль/мг белка, тогда как при ее отсутствии - 164,3 107,4

фемтомоль/мг белка (р≥1).

Индивидуальный анализ полученных данных показал, что у пациенток с успешной имплантацией частота встречаемости нулевых значений уровня

66

стероидных рецепторов в цитозоле эндометрия достоверно ниже по сравнению со второй группой: для РП - 37% против 57% (р≤0,05), для РЭ -

12% против 42% (р≤0,01) Не удивительно, что это правило распространяется и на отрицательные по обоим рецепторам образцы эндометрия: 12% в первой группе (успех имплантации) против - 29% во второй (р≤0,01).

Таким образом, окончательный анализ результатов нашего исследования не подтвердил гипотезу о достаточной информативности рецепции стероидов в эндометрии для прогноза успеха ЭКО. При этом,

биопсия эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является причиной отказа пациенток от нее. Более того,

массированная инфильтрация эндометрия иммунокомпетентными клетками в период имплантационного окна [52] позволяет переместить наше внимание на рецепцию женских половых стероидов именно в этих клетках.

3.2. Данные лабораторного исследования крови пациенток.

3.2.1. Общая картина крови.

Результаты общего анализа крови у пациенток, включенных в наше исследование, представлены в таблице 3.2.

Таблица 3.2. Общий анализ крови пациенток программы ЭКО.

Показатель (ед. измерения)	Общий анализ	Нормативные
	крови пациенток	показатели
Эритроциты (х1012/л)	4,28±0,5	3,7-4,7
Лейкоциты (х1012/л)	6,36±1,2	4-9
Тромбоциты (х109/л)	229,25±31,2	180-320
Палочкоядерные клетки (%)	1±0,02	1-5
Сегментоядерные клетки (%)	59,3±3,4	45-70

67

Эозинофилы (%)	1,4±0,5	1-5
Базофилы (%)	0,5±0,03	0-1
Лимфоциты (%)	31,7±5,0	20-40
Моноциты (%)	6,1±0,9	2-10

Как видно из таблицы, состав крови пациенток находился в пределах референсных значений.

Нами так же был проведен сравнительный анализ показателей клеточного состава крови пациенток I и II групп (таблица 3.3.).

Таблица 3.3. Клеточный состав крови пациенток программы ЭКО до начала стимуляции в зависимости от успеха имплантации.

Показатель (ед. измерения)	I группа	II группа	Нормативные
	(сть	(нет	показатели
	имплантация)	имплантации)
Эритроциты (x1012/л)	4,27 0,31	4,38 0,32	3,7-4,7
Тромбоциты (x109/л)	244 55,6	231 29,2	180-320
Лейкоциты (x1012/л)	6,16 1,39	6,21 1,59	4-9
Палочкоядерные %	1,7 1,25	2,29 1,38	1-5
Сегментоядерные %	58,42 0,31	60,97 7,3	45-70
Эозинофилы %	1,7 0,92	1,5 1,5	1-5
Базофилы %	0,54 0,57	0,01 0,03	0-1
Моноциты %	6,26 2,5	4,27 0,31	2-10
Лимфоциты %	32,24 6,8	28,74 11,35	20-40

68

Как видно из таблицы № 3.3., все показатели клинического анализа

крови пациенток находятся в пределах нормы и не влияют на успех

имплантации.

3.2.2. Результаты исследования состава МНФК периферической крови.

Принимая во внимание, что основным объектом нашего исследования являлась мононуклеарная фракция периферической крови пациенток, нами был проведен индивидуальный анализ данной фракции на содержание В- и

Т-лимфоцитов и моноцитов с помощью проточного цитофлюориметра сортера FACSAria (Becton Dickenson Co). Результаты проведенного исследования отражены в таблице 3.4.

Таблица 3.4. Результаты анализа мононуклеарной фракции периферической крови у пациенток, включенных в программу ЭКО.

69

Из представленных результатов видно, что полученные данные не

отличаются от нормативных показателей мононуклеарной фракции

периферической крови пациенток.

3.2.3. Результаты исследования содержания гормонов в плазме крови у

пациенток до лечения.

Исследование гормонального статуса является обязательной процедурой для всех пациенток с бесплодием, в том числе включенных в программу ЭКО. Показатели гормонального статуса женщин, включенных в программу ЭКО до начала стимуляции суперовуляции представлены в таблице 3.5.

Таблица 3.5. Показатели гормонального статуса без значений прогестерона и эстрадиола в плазме крови обследованных пациенток,

включенных в программу ЭКО до начала стимуляции (21 - 23 день м.ц. 22±1).

Исследуемый	I группа (есть	II группа (нет	Нормативные		Единицы
гормон	имплантация)	имплантации)	значения		измерения
	n=28	n=22
ФСГ	7,2±1,6	7,4±1,9	2 – 12		мМЕ/мл
ЛГ	5,5±1,3	5,0±1,4	0,61	– 16,3	мМЕ/мл
ЛГ/ФСГ	0,78±0,2	0,75±0,4	0,3	– 1,4	мМЕ/мл
ТТГ	1,7±0,6	1,8±0,62	0,4-4,2		мкМЕ/мл
Пролактин	317±103	293±94	40-530		мМЕ/мл
Тестостерон	2,2±0,9	2,2±0,8	0,7-4,13		нмоль/л

70

Исследования гормонального статуса пациенток на 21 - 23-й дни менструального цикла (до включения в программу ЭКО) показали, что уровни гонадотропинов, их соотношение, концентрация ТТГ, у всех женщин не выходили за пределы референсных значений. Уровень ФСГ в первую фазу менструального цикла колебался от 4,2 до 9,8 мМЕ/мл у пациенток I группы,

от 3,2 до 9,9 мМЕ/мл - у пациенток II группы, составив в среднем в исследуемых группах 7,2±1,6 и 7,4±1,9 мМЕ/мл соответственно (p>0,05).

Количество ЛГ в первую фазу менструального цикла у пациенток I

группы варьировало от 3,2 до 8,2 мМЕ/мл, у пациенток II группы - от 2,2 до

8,6 мМЕ/мл, в среднем в исследуемых группах - 5,5±1,3 и 5,0±1,4

соответственно мМЕ/мл (p>0,05).

Соотношение ЛГ/ФСГ колебалось от 0,58 до 1,53 у пациенток I группы,

от 0,31 до 1,62 - у пациенток II группы, в среднем составив в исследуемых группах 0,78±0,2 и 0,75±0,4 соответственно (p>0,05).

Уровень пролактина изменялся от 143 до 489 мМЕ/мл у пациенток I

группы, от 130 до 437 мМЕ/мл- у пациенток II группы, в среднем в исследуемых группах составил 317±103 и 293±94 мМЕ/л соответственно

(p>0,05).

Содержание тестостерона составило от 1,1 до 3,82 нмоль/л у пациенток

I группы, от 0,92 до 3,86 нмоль/л - у пациенток II группы, в среднем в исследуемых группах составив 2,2±0,9 и 2,2±0,8 нмоль/л соответственно

(p>0,05).

Уровень ТТГ изменялся от 0,82 до 2,86 мкМЕ/мл - у пациенток I

группы, от 0,85 до 2,96 мкМЕ/мл - у пациенток II группы, в среднем в исследуемых группах этот показатель составил 1,7±0,6 и 1,8±0,6 мМЕ/л

соответственно (p>0,05).