Диссертация на соискание учёной степени

характеристики активности как средние времена пребывания канала в

открытом и закрытом состояниях ( open , closed ). Среднее время пребывания

канала в открытом состоянии определяется как сумма длительностей интервалов пребывания в открытом состоянии ( open ), отнесенная к числу

	открытий	в процессе	проведения эксперимента (nopen):				open		open . Для
									nopen
	закрытого	состояния,	соотвтетсвенно:	closed		closed	, где	nclosed – число
						nclosed

закрытий канала, closed – времена пребывания канала в закрытом состоянии (см. рис. 3.11). В процессе моделирования динамики RyR-канала изучалось влияние вероятностей электронных переходов на эти кинетические характеристики.

Рис. 3.11. Зависи-

мость активности RyR-канала от времени, интервалы пребывания канала в открытом и закрытом состояниях.

В рамках предложенной схемы проведены численные эксперименты по изучению кинетических характеристик виртуального статистического ансамбля

RyR-каналов, состоящего из восьмидесяти одного объекта при одинаковых условиях. Выбирался некоторый фиксированный набор параметров ЭК модели,

при котором глобальный минимум КП соответствует закрытому состоянию: a 5, K 12, p 0.85 , 7 .

На рисунке 3.12 представлены графики распределений времен пребывания канала в открытом состоянии при различных значениях интенсивности электронных переходов, связанных с отсоединением ионов Са2+ от активационного центра ( au ). Стрелками на графиках обозначены средние времена пребывания канала в открытом состоянии ( open ). Как видно из

рисунка, с увеличением au происходит уменьшение open . Этот факт

91

подтверждает				и	рисунок
open	( au ) .
		0.6			=0.2 мс-1
						au
		0.5			0.2 e-0.2 t
	)	0.4
	close	0.3
	P(
		0.2	< open>=4.42 мс
		0.1
		0.0
		0	5	10	15	20	25	30
				open,		мс

3.13, на котором

			au=0.4 мс-1
			0.4 e-0.4 t
	< open>=2.35 мс
0	5	10	15	20	25	30
		open, мс

представлена зависимость

				au=0.6 мс-1
				0.6 e-0.6 t
	< open>=1.6 мс
0	5	10	15	20	25	30
		open, мс

Рис. 3.12. Гистограммы плотности распределений времен пребывания канала в открытом состоянии при различных значениях интенсивности электронных

переходов au . ib 0.001 мс-1, tun 0.025 мс-1

Согласно марковской схеме (3.10), плотность распределения времен

пребывания в открытом состоянии можно оценить как [118]:
f (	open	)	closed		e open closed ,	(3.12)
где closed au				tun ib – интенсивность выхода канала		из открытого

состояния.

Среднее время пребывания канала в открытом состоянии

(математическое ожидание) определяется как:

	open	1	.	(3.13)
			closed

На рисунке 3.12 гистограммы плотности распределений времен пребывания канала в открытом состоянии аппроксимируются по формуле

(3.13). Как видно из рисунков, марковское приближение хорошо согласуется с компьютерным экспериментом.

92

open

	40
				tun=0.025 мс-1
	30			tun=0.05 мс-1
				tun=0.1 мс-1
мс
>,	20
open
<
	10
	0
	1E-3	0.01	, мс-1	0.1	1
			au

Рис. 3.13. Зависимость среднего времени пребывания канала в открытом состоянии от интенсивности электронных переходов в закрытое состояние au при различных интенсивностях туннельных переходов.

Представленные на рисунке 3.13 графики зависимостей от

интенсивности электронных переходов, связанных с отсоединением ионов Са2+

от активационного центра RyR-канала показывают, что с ростом au

сокращается среднее время пребывания канала в открытом состоянии.

Сплошные линии на графике соответствуют марковскому приближению

open au , которое совпадает с результатами численных экспериментов.

При анализе результатов численных экспериментов по изучению активности RyR-каналов исследовалось влияние интенсивности электронных переходов на времена пребывания канала в закрытом состоянии ( closed ).

Гистограммы распределений по временам пребывания в закрытом состоянии представлены на рисунке 3.14.

93

	0.3	ab=0.1 мс			-1
		(0.1 e-0.1 t+0.01e-0.01 t)/2
	0.2	closed1=10 мс				-1
)
closed			closed2	=100 мс-1
f(
	0.1
	0.0
		0	50	100		150
		closed, мс

ab=0.2 мс-1
(0.2 e-0.2 t+0.01e-0.01 t)/2
	closed1	=5 мс-1
	closed2	=100 мс-1
0	50	100	150
closed, мс

	ab=0.3 мс-1
	(0.3 e-0.3 t+0.01e-0.01 t)/2
	closed1	=3‏.3‏мс-1
	closed2	=100 мс-1
0	50	100	150
closed, мс

Рис. 3.14. Гистограммы плотности распределений времен пребывания канала в закрытом состоянии при различных значениях интенсивности электронных переходов au . iu 0.025 мс-1.

Плотность распределения времен пребывания в закрытом состоянии

описывается суммой двух экспоненциальных функций:

f ( closed ) abe abt iu e iut / 2 .

(3.14)

Плотность распределения определяется двумя характерными средними

временами, которые в случае данной марковской схемы соответствуют средним

временам пребывания в закрытом ( closed1 )

и инактивационном состояниях

(

). Эти времена соответственно равны:

1

и

1

.

closed2

closed1

closed2

ab

iu

Среднее время пребывания канала в закрытом состоянии определяется как

среднее данных времен:

closed

closed1 closed2 .

(3.15)

2

На рисунке 3.15 представлены графики зависимости среднего времени пребывания RyR-канала в закрытом состоянии от интенсивности переходов ab

при различных интенсивностях электронных переходов, связанных с отсоединением ионов Са2+ от инактивационного центра канала ( iu ). Сплошные линии соответствуют марковскому приближению (3.10).

94

	200	iu=0.01	-1
			мс
		iu=0.02 мс-1
	150	iu=0.03	-1
			мс
>, мс
	100
closed
<
	50
	0
	0.01	0.1	1
		, мс-1
		ab

Рис. 3.15. Зависимость среднего времени пребывания канала в открытом состоянии от интенсивности электронных переходов в открытое состояние ab при различных интенсивностях электронных переходов в инактивационное состояние iu .

Как видно из графика, с увеличением интенсивности ab уменьшается среднее время пребывания канала в закрытом состоянии. В этом случае марковское приближение также хорошо согласуется с численным экспериментом.

Согласно экспериментальным данным [15] с ростом cis[Ca] от 0.05 до 50

мкМ среднее время пребывания канала в закрытом состоянии уменьшается от

87 мс до 47 мс, что согласуется с результатами численных экспериментов в рамках электронно-конформационной модели.

3.3.2 Зависимость вероятности электронных переходов от cis[Ca]

При разработке электронно-конформационной модели было сделано предположение о зависимости вероятности электронных переходов от концентрации Са2+ в cis-части (cis[Ca]) в терминах вероятности присоединения ионов к активным центрам канала. Считалось, что электронный переход может быть совершен в случае присоединения более чем k ионов Са2+ к активным центрам RyR-канала, состоящим из z активных мест присоединения, согласно формуле (2.10). На рисунке 3.16 изображены в логарифмических координатах графики зависимостей интенсивностей электронных переходов a b от cis[Ca]

при различных значениях числа z (мест присоединения активного центра

95

канала), и при различных значениях концентрации Са2+ в cis-части, достаточной для заполнения всех мест связывания на активном центре (cis[Ca]max). Как видно из графиков, насыщение зависимости a b (cis[Ca]) достигается быстрее при малых значениях z и малых значениях cis[Ca]max.

а.							б.
20						20	cis[Ca]max=3000	мкМ
							cis[Ca]max=3500 мкМ
15						15	cis[Ca]max=4000 мкМ
					-1		cis[Ca]max=4500	мкМ
-1					, мс
					b
,мс
10					a	10
a b
				z=25
5				z=50		5
				z=100
				z=150
0						0
0.1	1	10	100	1000		0.01	0.1	1	10	100	1000
		cis[Ca], мкМ						cis[Ca], мкМ

Рис. 3.16. Зависимость интенсивностей электронных переходов от концентрации Са2+ в cis-части при различных значениях числа секторов на активных центрах (а.) и

при различных значениях максимального уровня концентрации cis[Ca]max (б.).

10		a b
-1		i b
, мс
1
1	2	3	4
	cis[Ca], мкM

Рис. 3.17. Зависимости интенсивностей электронных переходов от уровня цитозольного Са2+.

В модели вводились переменные kab – минимальное число ионов Са2+,

необходимых для связывания с активационным центром; kib – минимальное число ионов Са2+, необходимых для связывания с инктивационным центром для изменения состояния канала. Расчеты проводились при kab=4, kib=7, что соответствует предположительному числу ионов, необходимых для связывания

сактивационным и инактивационным центрами, соответственно.

Максимальное число мест связывания активационного и инактивационного

центров: z=50. Максимальная концентрация кальция: cis[Ca]max =4 мМ [20].

96

Зависимости интенсивностей электронных переходов представлены на рисунке

3.17.

3.4 Активация одиночного канала

На первом этапе проведения численных экспериментов проведено моделирование процесса активации канала при резком увеличении уровня цитозольного кальция. В начале эксперимента все каналы, входящие в статистический ансамбль, находятся в минимуме конформационного потенциала С, то есть в электронно и конформационно закрытом состоянии.

Для ансамбля, состоящего из 81 RyR-канала, вероятность пребывания в открытом состоянии в текущий момент времени равна:

P	Nopen	,	(3.16)
open	81

где Nopen – число открытых каналов в текущий момент времени.

На рисунке 3.18 представлены зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии (Popen) от времени при резком увеличении уровня cis[Ca]

от 0 до 1 мкМ в момент времени t=0. Данные результаты получены из численных экспериментов при различных значениях интенсивности электронной активации канала a b . Этот параметр варьировался с целью определения влияния вероятности электронных переходов на длительность процесса открытия RyR-канала.

97

а.1.0								Рис. 3.18. Вероятность
	0.8							пребывания		канала	в
								открытом	состоянии		в
open	0.6							ансамбле	после резкого
							-1	повышения
P				a b		= 2 мс
	0.4
								концентрации Са2+ в cis-
					a b	= 1 мс-1
	0.2							части. а. Зависимость
						= 0.2 мс-1
					a b			вероятности		Popen	от
	0.0
б. 1								времени. б. Зависимость
	мкМ							концентрации Са2+ в cis-
								части от времени.
	cis[Ca],
	0
	0	5	10	15				20

t, мс

Анализируя графики, можно сделать вывод, что зависимость P (t)

open

носит экспоненциальный характер, причем скорость увеличения Popen зависит от a b .

Для всех физических, биологических и химических характеристик,

изменяющихся во времени экспоненциально, вводится понятие постоянной времени τ [117]. Физический смысл этого параметра следующий: он соответствует времени, за которое значение исследуемой величины увеличивается ровно в е раз, то есть τ характеризует скорость изменения исследуемой временной зависимости.

При изучении процесса открытия одиночного канала введена постоянная времени открытия opening . Эта величина соответствует моменту времени t, при

котором Popen			достигает уровня:
P	(		) =	e 1	.	(3.17)
		opening
open				e

На рисунке 3.18 величина вероятности пребывания в открытом состоянии

оценивается как P ( ) 0.632 (пунктирная линия).

open opening

Зависимость значения τopening от интенсивности электронных переходов

a b представлена на рисунке 3.19.

98

	12			Рис. 3.19. Зависимость времени
	11
				активации одиночного RyR-
	10
	9			канала от интенсивности
мс	8			активации (электронных
	7			переходов a b ).
,	6
opening
	5
	4
	3
	2
	1
	0
	0.1		1	10
			a b	, мс-1

Из рисунка видно, что при a b 2 мс 1 величина τopening сначала уменьшается,

а затем достигает некоторого стационарного значения 1.22 мс. Это значение соответствует длительности медленной конформационной релаксации RyR-

канала в открытое состояние.

Вряде работ процесс активации RyR-канала при повышении уровня cis[Ca]

влипидном бислое исследован экспериментально [24]. Для резкого повышения уровня cis[Ca] в основном применяются две методики. Первая из них заключается в высвобождении связанного Са2+ из сложных структур,

находящихся в растворе, с помощью лазерного (или ультрафиолетового) флэш-

фотолиза [25, 29, 106], во второй методике уровень cis[Ca] повышается механически, то есть увеличивается концентрация Са2+ вблизи канала в растворе [31, 119].

Результаты, полученные с помощью методики лазерного флэш-фотолиза,

говорят о том, что постоянная времени активации канала составляет ~1 мс [25].

При механическом увеличении уровня кальция в растворе эта величина была немного больше и варьируется в интервале 2-20 мс [31].

Проведя анализ результатов численных экспериментов, можно сделать вывод, что они с хорошей степенью точности согласуются с этими экспериментальными данными.

99

3.5 Исследование процесса закрытия RyR-канала

На следующем этапе проведены численные эксперименты с целью изучения процесса закрытия RyR-канала вследствие резкого понижения уровня

cis[Ca].

Согласно формуле (2.10), при малом значении cis[Ca] вероятность присоединения ионов Са2+ к активационному центра RyR-канала становится малой по сравнению с вероятностями процессов закрытия RyR-каналов,

связанных с отсоединением ионов от активационного центра (с

интенсивностью a u ) и туннелированием в закрытое состояние (с

интенсивностью tun ).

В начале численного эксперимента все каналы в статистическом ансамбле находятся в открытом состоянии A*I (О). В момент времени t=0 уровень cis[Ca]

уменьшается ступенчатым образом от 1 мкМ до нулевого значения (cis[Ca] =0) .

В результате проведения экспериментов получены графики зависимостей

вероятности пребывания в открытом состоянии P (t)	при различных
open

значениях интенсивностей вероятности отсоединения ионов от активационного центра a u (рис. 3.19). В данной серии экспериментов параметр a u

варьировался с целью исследования влияния вероятности отсоединения ионов Са2+ от активационного центра на процесс закрытия RyR-канала.

100