Диссертация на соискание учёной степени
.pdfРис. 2.1. Представление RyR-канала в электронноконформационной модели. 1 – конформационная, 2 – электронная степени свободы. Слева: канал открыт электронно и конформационно. Справа: канал закрыт электронно и конформационно.
Вышеизложенные положения ЭК-модели можно описать с помощью примитивной схемы эластичной трубки с переменным сечением и легкой крышкой. В данной схеме конформационная координата Q характеризует степень упругой деформации (сечение) трубки, а положению «крышки» соответствует электронная степень свободы RyR-канала. Переключение положения легкой «крышки» влечет за собой медленное конформационное изменение канала.
Динамические процессы RyR-канала условно осуществляются в два этапа: сначала при фиксированной конфигурационной степени свободы быстро перестраивается активационный центр, а затем идет медленная перестройка конформационной степени свободы с переходом в полное равновесие в данном электронном состоянии.
Разработка ЭК-модели основывалась на прямой аналогии между изменением конформации RyR-каналов как супрамолекулярных комплексов и изменением конфигурации многоатомной молекулы [100].
Основные приближения ЭК-модели модели базируются на представлениях теории электронно-колебательного взаимодействия в физике твердого тела
[101]. Детали проведенной аналогии представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Аналогия между теорией электронно-колебательного взаимодействия в
молекулах и электронно-конформационной теорией динамики RyR-канала.
41
|
|
Теория |
|
электронно- |
Электронно- |
|
|
||||
|
|
колебательного |
|
|
|
конформационная |
|
теория |
|||
|
|
взаимодействия |
|
|
динамики RyR-канала |
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
Адиабатическо |
Электроны |
|
успевают |
Разделение |
динамики |
канала |
||||
е приближение |
адиабатически |
следовать |
за |
на медленную конформационную |
|||||||
|
|
ядрами, и их распределение в |
и быструю электронную. |
|
|||||||
|
|
пространстве |
определяется |
|
|
|
|
|
|||
|
|
мгновенной |
конфигурацией |
|
|
|
|
|
|||
|
|
ядер. Существует возможность |
|
|
|
|
|
||||
|
|
разделения |
электронных |
и |
|
|
|
|
|
||
|
|
ядерных координат. |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|||||||
|
Медленная |
Конфигурационная |
|
Конформационная координата |
|||||||
степень свободы |
координата ядер |
|
|
|
RyR-канала |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
||||||
|
Быстрая |
Электронная |
|
степень |
Электронная степень свободы |
||||||
степень свободы |
свободы, |
малая |
масса |
канала, |
|
|
определяемая |
||||
|
|
электрона, |
достаточно большой |
связыванием |
|
|
Са2+ |
с |
|||
|
|
масштаб электронных энергий |
активационными |
центрами |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
канала |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
Взаимодействи |
Кулоновское |
|
|
|
Электронно- |
|
|
|
||
е |
между |
взаимодействие |
электронов |
с |
конформационное |
|
|
||||
степенями |
ядрами |
и |
межъядерное |
взаимодействие: |
изменения |
||||||
свободы |
отталкивание |
|
|
|
конформации |
канала |
как |
||||
|
|
|
|
|
|
|
следствие |
|
|
электронных |
|
|
|
|
|
|
|
|
переходов |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
Устойчивость |
Существование |
двух |
Существование |
|
двух |
|||||
состояний |
устойчивых |
|
состояний |
устойчивых |
состояний |
канала, |
|||||
|
|
молекулы, |
соответствующих |
соответствующих |
открытому и |
||||||
|
|
высокосимметричной |
|
и |
закрытому |
состояниям |
канала |
||||
|
|
низкосимметричной |
|
|
(аналог псевдоэффекта Яна- |
||||||
|
|
конфигурациям |
|
молекулы |
Теллера). |
|
|
|
|
||
|
|
(псевдоэффект Яна-Теллера). |
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Два положения электронной степени свободы (открытое и закрытое)
можно описать в рамках псевдоспинового формализма S=1/2 c состояниями
42
«вверх» и «вниз» ( , ). Изменение конформационной координаты Q в ЭК-
модели описывается в классическом континуальном приближении.
По аналогии с теорией электронно-колебательного взаимодействия в конденсированном состоянии вводилось понятие адиабатического приближения, базирующегося на следующем факте: ядра значительно массивнее электронов и, следовательно, движутся медленнее, чем электроны.
Движение ядер приводит лишь к изменению электронного распределения без переходов между различными электронными состояниями.
По аналогии с вышеизложенной теорией моделирование поведения одиночного RyR-канала проводится в условиях адиабатического приближения,
то есть в предположении возможности разделения динамики электронного и конформационного состояний канала.
2.1.1 Гамильтониан канала
При описании свойств RyR-канала предполагается, что на его энергетическое состояние оказывают влияние следующие основные факторы:
конформационное состояние канала,
взаимодействие электронной и конформационной степени свободы,
концентрация Са2+ в люмене СР.
Используя псевдоспиновый формализм[101], в рамках энергетического
подхода к описанию состояний канала вводится модельный гамильтониан:
H sz |
hsx |
pQ aQsz |
|
|
K |
Q2 |
, |
(2.1) |
|||||||||||
2 |
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
где sx |
|
1 |
|
0 |
1 |
|
, sz |
|
1 |
|
1 |
0 |
|
– матрицы Паули. |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||
|
|
2 |
|
1 |
0 |
|
|
|
2 |
|
0 |
1 |
|
|
|
|
|
В (2.1) первое слагаемое описывает разницу энергий двух электронных
состояний канала («открыт» |
|
и «закрыт» |
), второе слагаемое описывает |
||
|
|
|
|||
«перемешивание» |
и |
состояний; параметры h и являются аналогами |
|||
|
|
|
|
|
|
некоторого «эффективного поля». Третий член описывает эффекты воздействия
43
на канал со стороны внешних сил, которые условно можно связать с эффективным давлением (p – параметр «эффективного давления» Са2+ в
люмене СР). Четвертый член характеризует электронно-конформационные взаимодействия, возникающие в каналах, где a – постоянная взаимодействия.
Последнее слагаемое описывает упругую энергию конформационного состояния канала с константой упругости K.
2.1.2. Конформационный потенциал
Для описания динамики электронного состояния были найдены собственные значения гамильтониана (2.1):
|
K |
|
|
1 |
|
1 |
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
||||
E (Q) |
Q2 |
pQ |
[( aQ)2 |
h2 ] |
2 |
, |
(2.3) |
|||
2 |
2 |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
которые определяют две ветви адиабатического конформационного потенциала (КП) (рис. 2.2а) и характеризуют энергию состояний канала в зависимости от координаты Q. E – верхняя ветвь, E – нижняя ветвь потенциала.
Можно ввести новую переменную , описывающую электронное состояние канала, которая принимает только два значения ( =0 – закрытое, =1 –
открытое состояния). Это позволяет переписать собственные значения (2.3) в
следующем виде:
|
K 2 |
1 |
1 |
|
|
|||
|
|
|
|
|
||||
|
2 2 2 |
|
(2.4) |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
E(Q, ) 2 Q pQ ( 1) |
|
2 [( aQ) h ] , |
||||||
|
|
На рисунке 2.2а представлен вид адиабатического конформационного потенциала RyR-канала, на котором обозначены основные состояния канала в электронно-конформационной модели. сС– канал закрыт электронно и конформационно, оC – открыт электронно и закрыт конформационно, оO –
канал открыт электронно и конформационно, сO – закрыт электронно и открыт конформационно.
44
а. |
б. |
Рис. 2.2 Конформационный потенциал RyR-канала, стрелками обозначены электронные (сплошные) и конформационные (штрихованные) переходы. Параметры потенциала: а=5, K=12, p=-0.86. а. Общий вид конформационного потенциала, общий случай (адиабатический режим). б. Частный случай конформационного потенциала при h 0, =0 (диабатический режим).
Если пренебречь квантовыми эффектами ( h 0 ) и положить 0 , то формула, описывающая КП упрощается следующим образом:
E(Q, ) |
K |
Q2 pQ ( 1) |
1 |
aQ . |
(2.5) |
||
|
|
||||||
|
|
2 |
|
2 |
|
|
|
В этом |
|
случае |
график зависимости конформационного |
потенциала |
|||
E E(Q, ) |
представляет собой две пересекающиеся параболы |
(рис. 2.2б) |
(диабатический режим), тогда собственные значения можно разделить согласно состоянию электронной степени свободы: ветвь E (Q) – электронно открытое, E – электронно закрытое состояния.
Форма КП определяет устойчивость того или иного фазового состояния канала (стабильность или метастабильность). Как видно из рисунка 2.2
минимум oO является метастабильным, а сС – глобальным. Предполагается,
что при внешних воздействиях на систему возможно изменение формы КП, а,
следовательно, стабильности локальных минимумов и устойчивости фазовых структурных состояний.
2.1.3 Влияние уровня trans[Ca] на форму конформационного потенциала RyR-канала
Основываясь на экспериментальных данных in vitro, указывающих на то, что вероятность пребывания канала в открытом состоянии увеличивается с ростом
45
уровня концентрации Са2+ )[20], в рамках электронно-
конформационной модели предполагается, что устойчивость состояний RyR-
канала зависит от , то есть в клетке – от концентрации Са2+ в люмене
СР.
Во многих экспериментальных работах высказано предположение о наличии так называемого активационного центра RyR-канала со стороны trans. В
терминах кинетики ферментативных процессов реакции фермента Е
(активационного центра канала) с субстратом S (ионами Са2+) образуется комплекс фермент-субстрат ES [103, 104]. Если реакция обратима, и известны константы прямой и обратной реакции k+ и k-, соответственно, то схема процесса образования комплекса ES имеет вид:
E S k ES
k
Предполагается, что активационный центр разделен на определенное количество мест связывания с ионами. Согласно формуле Хилла доля мест связывания активационного центра, занятых субстратом выражается как:
(trans[Ca])n , (trans[Ca])n KCan
где KCa k – коэффициент диссоциации субстрата от активного центра, k+ k
– константа скорости связывания молекулы субстрата с одним из активных центров, k- – константа распада, n – коэффициент Хилла, который определяет количество активных мест связывания и другие кооперативные механизмы регуляции функции канала.
Относительное число активных мест связывания варьируется в диапазоне
[0;1], а при trans[Ca] KCa значение равно ½.
Для описания внешнего воздействия со стороны ионов Са2+ в trans-части в ЭК-модели вводится параметр «эффективного давления» p, зависящий от trans[Ca] . Для удобства зависимость p( trans[Ca] ) приводится к такому виду, что значения р лежат в диапазоне (-1;1) в соответствии с формулой [95]:
46
p 2 1 2 |
(trans[Ca])n |
|
1 |
(2.6), |
(trans[Ca])n K |
n |
|||
|
Ca |
|
|
|
где KCa – уровень trans[Ca], при котором p принимает нулевое значение, n –
параметр, определяющий нелинейность зависимости p(trans[Ca]). В
гамильтониане (2.1) параметр р определяет энергию внешнего воздействия на систему.
а.
б.
Рис 2.3 Влияние люменального Са2+ на конформационный потенциал канала. а. График зависимости значения параметра эффективного давления p от уровня trans[Ca]. (Kca=200 мкМ, n=6) б. Форма конформационного потенциала при различных значениях параметра p. Левый минимум соответствует закрытому, правый – открытому состоянию RyR-канала. Параметры потенциала: а=5, K=12, p=-0.86.
График зависимости p(trans[Ca]) представлен на рисунке 2.3а. На графике
2.3б изображены формы КП при трех различных значениях параметра p. Как видно из рисунка, при p<0 (малый уровень trans[Ca]) наблюдается устойчивость закрытого состояния RyR-канала, при p=0 закрытое и открытое состояния находятся на одном энергетическом уровне, а при p>0 (высокий уровень trans[Ca]) наблюдается устойчивость открытого состояния.
Таким образом, в ЭК-модели параметр «эффективного давления» вводится для описания зависимости устойчивости состояний исследуемого макромолекулярного комплекса от внешних условий.
2.1.4. Структурные изменения канала в электронно-конформационной модели
На основе представлений ЭК-модели можно рассмотреть возможные
варианты процессов открытия и закрытия канала при постоянстве формы КП,
47
связанные с взаимодействием ионов Са2+ с активационным центром канала и
последующим изменением конформационного состояния. Простейшие схемы
открытия и закрытия канала показаны на рисунке 2.3.
E |
|
|
E |
E+(Q) |
E-(Q) |
E+(Q) |
E-(Q) |
|
|
||
1 |
|
|
|
2 |
Q |
2 |
Q |
|
|||
O |
|
|
O |
|
С |
|
|
С |
|
|
|
|
Схема 2. Отсоединение ионов Са2+ от |
||
Схема 1. Связывание ионов Са2+ с |
|
||
активационной частью. Открытие |
|
активационной части. Закрытие канала. |
|
|
|
|
|
канала. |
|
|
|
Рис. 2.3 Схемы процессов открытия и закрытия канала. Взаимодействие ионов Са2+ с активационной частью канала в ЭК модели.
Схема 1. Открытие канала. Вначале канал находится в закрытом состоянии на левой ветви конформационного потенциала в минимуме (С), при этом имеют место следующие изменения степеней свободы RyR-канала:
1 – ионы Са2+ связываются с активационным центром канала, происходит переход на более высокий энергетический уровень, то есть изменение электронной степени свободы и переход на правую ветвь КП.
2 – происходит изменение конформационной координаты Q: релаксация канала со временем в минимум правой ветви КП (О). Соответственно, канал оказывается в электронно и конформационно открытом состоянии.
Схема 2. Закрытие канала. В начальный момент времени канал находится в открытом состоянии в минимуме (О) на ветви КП E (Q) . Наблюдаются следующие изменения степеней свободы RyR-канала:
1 – ионы Са2+ отсоединяются от активационного центра канала, происходит переход на более высокий энергетический уровень, т.е. изменение электронной степени свободы и переход на ветвь КП E (Q) .
2 – происходит изменение конформационной координаты Q, релаксация в
48
минимум левой ветви КП (С). В итоге RyR-канал электронно и конформационно закрыт.
Переходы между состояниями на вышеприведенных схемах в рамках рассматриваемой модели будут подробно описаны далее.
2.1.5 Динамика конформационной координаты
Изменение конформационной координаты канала Q можно описать с помощью уравнения Ланжевена [105]:
.. |
|
. |
|
|
M Q |
E(Q, ) M Q |
(2.7) |
||
Q |
||||
|
temp |
|
||
|
|
|
где M – параметр эффективной массы RyR-канала (для упрощения принимается М=1);
– переменная, описывающая электронное состояние канала ( 0 –
электронно-закрытое, и 1 – электронно-открытое); – параметр конформационного «трения» (параметр диссипации); temp – сила случайных температурных флуктуаций в конформационной динамике RyR-канала.
Если пренебречь случайными тепловыми флуктуациями ( temp 0), то уравнение Ланжевена является вторым законом Ньютона. В этом случае (2.5)
описывает процессы релаксации конформационной координаты по ветвям конформационного потенциала к их минимумам: QсС – для электронно-
закрытого, QoO – для электронно-открытого канала (рис.2.2).
2.1.6 Динамика электронной степени свободы
Как уже отмечалось ранее, процесс активации RyR-каналов напрямую зависит от концентрации Са2+ в cis-части и является результатом связывания ионов Са2+ с активационными центрами RyR-канала. Результаты экспериментальных исследований [106, 107] говорят о том, что переходы в открытое состояние наблюдаются при достаточно малом уровне Са2+ в cis-части
(~0.1 мкM).
Электронная степень свободы, в отличие от конформационной, является дискретной и в ЭК-модели описывается как марковский процесс с двумя
49
состояниями (0 и 1).
Описание электронных переходов в ЭК-модели строится на предположении,
что они обусловлены взаимодействием Са2+ с активными центрами канала, а их интенсивность зависит от энергии ионов Са2+ и энергии канала в текущем конформационном состоянии.
По аналогии с теорией неупругого рассеяния предполагается, что взаимодействие Са2+ с активными центрами рассматривается как резонансное рассеяние. В связи с этим, такие переходы носят резонансный характер, причем вероятность перехода Pelect может быть аппроксимирована спектральной функцией Лоренца (формулой Брейта-Вигнера) [109]:
Pelect (E, ) elect |
|
2 |
|
|
|
(2.8) |
|||||||
|
, |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
2 ( E)2 |
|
|
|
||||||||||
Где |
Е энергия ионов, |
|
E E |
|
|
энергия возбуждения (разность |
|||||||
|
|
||||||||||||
энергий |
двух |
ветвей |
конформационного |
потенциала), |
|
полуширина |
|||||||
резонансного |
пика, |
elect Pres Pelectr (E ) |
амплитуда |
вероятности, |
зависящая от концентрации ионов Ca2 в диадном пространстве.
Таким образом, описанные выше электронные переходы являются следствием взаимодействия активных центров канала с ионами Са2+, и их интенсивность зависит не только от концентрации данного субстрата, но и от энергии ионов Са2+, способных связываться с активными центрами.
2.1.7 Инактивационое состояние RyR-канала
Как отмечалось ранее, в работах [22-24] предполагается, что у RyR-
канала наряду с активационными существуют так называемые
инактивационные центры; на этом предположении основано большое количество моделей по исследованию кинетических свойств канала [24, 33, 34].
Экспериментально выявлено [25], что связываясь с активационным центром
канала ионы Са2+ переводят канал в конформационно открытое состояние, и
наоборот, связываясь с инактивационным центром – закрывают канал.
Ранее в электронно-конформационной модели учитывались только
50