6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

если культура не выделена ранее.

•Учет результата идентификации культуры холерного вибриона. Выдача окончательного ответа, если он не был выдан ранее.

•Учет результата идентификации неагглютинирующейся холерной О1 сывороткой культуры.

•Выдача окончательного отрицательного ответа, если культура не выделена на всех этапах исследования.

Исследование воды:

IIэтап (через 18 ч от начала исследования)

•Пересев с поверхности I-ой среды накопления в 10 мл 1% ПВ (II-ая среда накопления); инкубируйте при 37 оС 6 ч.

•Высев с поверхности I-ой среды накопления на пластинку МПА.

IIIэтап (через 24 ч от начала исследования)

•Высев с поверхности II-ой среды накопления на пластинку МПА.

Занятие 12

Исследование воды: IV и V этап

•Исследование посевов с I-ой и II-ой сред накопления:

•Просмотр посевов, отбор подозрительных на рост вибрионов типичных и атипичных колоний, проверка их в ОРА с холерными сыворотками О1, Инаба, Огава или О139.

•Отсев 2-3 колоний, агглютинирующихся и неагглютинирующихся холерными сыворотками, на полиуглеводную среду (например, лактозо-сахарозную), косячок МПА и МПБ. Инкубирование посевов при 37 ºС.

Методы ускоренной диагностики холеры. Исследование испражнений больного с типичной клиникой

257

•Применение МФА:

•Приготовление из нативного материала мазка, обработка его люминесцирующей холерной сывороткой и просмотр. Через 1,5-2 ч - предварительный ответ.

•Посев нативного материала по 0,1 мл в 5-8 мл 1% ПВ и на 4 чашки МПА. Через 3, 4, 5, 6 ч инкубирования при 37 ºС приготовление мазков с 1% ПВ и чашек (путем смыва физиологическим раствором), обработка их люминесцирующей холерной сывороткой и просмотр. Через 3–6 ч при нарастании количества специфически «окрашенных» вибрионов, определяемых в мазках, - ответ о наличии возбудителя холеры в исследуемом материале.

•Исследование нативного материала в РИВ под влиянием холерных сывороток 01 (разведение 1: 100), Инаба и Огава (разведении 1: 50). Через 15-20 мин - предварительный ответ.

•Исследование нативного материала в РА в 1% ПВ и в пробе с диагностическими холерными бактериофагами классическим и эльтор:

-добавление 2-3 капель исследуемого материала в разведенные 1% ПВ в объеме 1 мл холерные сыворотки О1, Инаба, Огава (с 1: 100 до титра) и контроль антигена (1 мл 1% ПВ). Контроль сыворотки: 1 мл сыворотки в разведении 1: 100 (без исследуемого материала). Учет реакции агглютинации через 1 ч. Приположительномрезультатевиден агглютинативный рост с просветлением среды при отсутствии агглютинации в контрольной пробирке. При отрицательном результате – гомогенное помутнение среды (наблюдение вести в течение 3 часов).

•Постановка пробы с холерными фагами классическим и эльтор двуслойным методом, внося в 5 мл расплавленного и охлажденного 0,7% ПЖА 0,5 мл

258

исследуемого материала (приложение). Учет фаголизиса через 1,5-2 ч инкубирования.

•При положительных результатах РА, фаголизиса и данных микроскопии - окончательный ответ.

•Постановка микрометодом РПГА и РТПГА с холерным иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом. Исследуемый материал предварительно прогреть в течение 20 мин при 100 ºС. Через 2 ч - предварительный ответ.

•Применение мультиплексного ПЦР-анализа нативного материала от больного холерой (занятие 4).

•Посев исследуемые испражнения в 5-8 мл 1% ПВ и на пластинку МПА для выделения культуры и ее изучения.

Занятие 13

Исследование воды:

Работа по плану занятия 10.

Ускоренная идентификация культуры по основным признакам

•Просмотр чашки МПА с посевом испражнений больного (предыдущее занятие), отбор подозрительных на рост вибрионов колоний.

•Микроскопия мазков, постановка ОРА с подозрительными колониями, используя агглютинирующую холерную 01 сыворотку.

•При положительной ОРА отсев колонии в 3 мл МПБ и после 3 ч инкубации изучение следующих признаков:

-агглютинабельности в пределах титра с холерными сыворотками О1, Инаба и Огава, разведенными 1% ПВ в объеме 1 мл (занятие 12).

-чувствительности к холерным фагам классическому и эльтор.

-ферментации сахарозы, маннозы, арабинозы с ис- пользованиемсредывобъеме0,5-1мл.Закапывание

259

во все пробирки по 1 капле изучаемой культуры.

•Учет результатов через 3-6 ч инкубирования посевов при 37ºС. При наличии четких положительных результатов - окончательный ответ о выделении возбудителя холеры.

Занятие 14 Исследование воды:

•Учет результатов изучения выделенной культуры.

•По результатам изучения культуры - окончательный ответ.

7.3. Серологическая диагностика

Серологические методы исследования, как правило, имеют дополнительное значение, и лишь в отдельных случаях при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа их результаты могут быть решающими.

Для серологической диагностики холеры используют иммунологическиереакции,выявляющиевсыворотке крови больных, переболевших и вибриононосителей, а также вакцинированных специфические антитела: агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела. Исследуют парные сыворотки с интервалом 7-10 дней. Первую пробу берут на 5-7 день болезни. В лаборатории сыворотки инактивируют при 56 ºС в течение 30 мин и при необходимости сохраняют при 4ºС.

Агглютинины у больных холерой появляются на 5-7 день заболевания и максимального титра достигают к 14-15 дню от начала заболевания. Затем их титр постепенно снижается.

Агглютинины в сыворотке крови больного холерой определяют в объемной реакции агглютинации. В качестве антигена используют живую культуру, выде-

260

ленную в очаге холеры, или диагностикумы - клетки холерных вибрионов, убитые кипячением или формалином. Диагностическое значение имеет четырехкратный и более высокий подъем титров антител при исследовании парных сывороток. Противохолерные антитела можно выявить методом фазово-контраст- ной микроскопии, используя в качестве индикаторного штамма культуру холерного вибриона, выделенную

вданном очаге, или музейный штамм того же биовара и серовара. Кроме того, можно поставить реакцию нейтрализации антигена (РНАг) с холерным иммуноглобулиновым эритроцитарным диагностикумом и РНГА с антигенным холерным эритроцитарным диагностикумом.

Вибриоцидные антитела в крови больных холерой

втитрах 10-1-10-3 обнаруживают с 1–3 дня болезни. Вибриоцидины достигают максимального значения (10-4-10-8) к 10-12 дню, а к 30 дню болезни быстро снижаются. У переболевших, вибриононосителей и вакцинированных титр вибриоцидных антител колеблется от 10-1 до 10-8.

Для выявления вибриоцидных антител предложен ряд методов, основанных на том, что в присутствии вибриоцидных антител в сыворотке не происходит размножение холерных вибрионов. Наиболее простыми и быстрыми являются методы, разработанные Домарадским И.В., Ерохиным Е.П. (1971), Наумшиной М.С. и др. (1973). Определение вибриоцидных антител этими методами основано на ферментации углеводов. О наличии или отсутствии вибриоцидных антител судят по разложению сахарозы, регистрируемому с помощью индикатора. В практических лабораториях для определения вибриоцидных антител также применяют микрометод Бененсона и др. (1968), макро- и

261

микрометод с использованием диагностикума холерного эритроцитарного О-иммуноглобулинового.

В сыворотках крови больных холерой, вибриононосителей и привитых холероген-анатоксином можно выявлять антитела к энтеротоксину холерного вибриона. Титр антитоксинов нарастает медленно и достигает максимального значения к концу 2-ой недели заболевания.

Для определения токсиннейтрализующих антител разработан ряд методов in vivo и in vitro. Наиболее трудоемкими являются методы с использованием животных: 10-дневных крольчат, изолированных петель взрослых кроликов, белых мышей. В практической работе целесообразно ставить РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (ЭХЭД). Диагностическим титром РНГА с ЭХЭД следует считать 1:160. Целесообразно исследовать парные сыворотки. Для определения токсиннейтрализующих антител можно использовать также реакцию преципитации в геле, встречный иммуноэлектрофорез, пробу Крейга.

Занятие 15

Определение агглютининов в парных сыворотках крови больного в объемной РА

•Титрование 1-ой и 2-ой инактивированных сывороток двукратно в 1% ПВ в объеме 1 мл (с 1:10 до 1:640); КС-сыворотка в разведении 1:10, КА – 1% ПВ.

•Внесение в пробирки с раститрованными сыворотками и в КА по 1 капле 3-часовой бульонной культуры холерных вибрионов О1 или О139 серогруппы.

•Инкубирование пробирки с реакцией при 37ºС; через 1 ч проведение предварительного учета результатов.

•Перенос пробирок в холодильник (при 4±0,5ºС). На

262

следующее утро - учет реакции. Положительной считайте РА на 3-4 креста в разведении 1:40 и выше. Диагностическое значение имеет четырехкратное и более нарастание титра антител.

Определение вибриоцидных антител в сыворотке крови больного

•Исследование сыворотки крови больного методом Наумшиной:

•Приготовление суспензии агаровой культуры V. cholerae eltor, содержащей 104 м.кл./мл.

•В восьми пробирках 10-кратно в объеме 0,9 мл на льду, который помещен в любую емкость, раститровать 2-ую инактивированную сыворотку в комплементе, разведенном 1:40. В девятую пробирку внести 0,9 мл комплемента (контроль).

•Во все пробирки, в том числе и контрольную, на холоду, добавить по 0,1 мл суспензии холерного вибриона, содержащей 104 м.кл./мл.

•Инкубирование смеси 37ºС в течение 1 ч.

•Агар для реакции готовится заранее. К 100 мл МПА pH 7,6 добавляют 1% сахарозы (2,5 мл 40% сахарозы), 0,1-0,2 мл спиртового насыщенного раствора основного фуксина и 2-3 мл 10% водного раствора сульфита натрия. Растворы фуксина и сульфита натрия предварительно подтитровывают. Цвет среды слегка розовый. АгарразливаютвчашкиПетрипо30мл.

•Предварительно простерилизованным металлическим пробойником (диаметр 10 мм) прорежьте агар в чашке Петри так, чтобы одна луночка находилась строго в центре чашки, а восемь – по окружности на одинаковом расстоянии друг от друга. Удалите из луночек агар, расплавьте и залейте им дно лунок.

•Помещение на лед штатива с пробирками и через 1 ч инкубирования внесение из каждой пробирки

263

отдельной стерильной пипеткой по 0,1 мл строго в центр соответствующей луночки агара смесь культуры и сыворотки. В девятую лунку перенести содержимое девятой пробирки (контроль).

•Накрывание чашки крышкой и, не переворачивая, установка на металлический лоток. Инкубирование

16-18 ч при 37 ºС.

•Учет результатов. В контроле должно быть покраснение среды (разложение сахарозы). Титр вибриоцидных антител определяют по 100% лизису вибрионов. За титр принимают максимальное разведение сыворотки, которое еще лизирует вибрионы (луночки не окрашены).

•Исследование парных сывороток больного микрометодомсдиагностикумомхолернымэритроцитарным О-иммуно-глобулиновым:

-внесение в два ряда лунок микротитровальной пластинки по 0,025 мл 1% ПВ.

-добавление в первые и последние лунки по 0,025 мл исследуемых сывороток 1: 10 и титратором, рассчитанном на 0,025 мл, титрование в 10 луноч-

ках (от 1: 20 до 1: 10240).

-приготовление из 18-часовой агаровой культуры

V. cholerae eltor суспензии 4х105 м.кл./мл и добавление в нее 1:1 комплемента, который предварительно развести в 5 раз.

-внесение в первые 10 лунок по 0,025 мл приготовленной суспензии холерного вибриона (концентрацией 2х105 м.кл./мл).

-выдерживание микротитровальной пластинки, прикрытой чистой крышкой, при 37оС на 5 ч.

-инактивирование содержимого лунок добавлением по 0,025 мл формалина, разведенного в 10 раз, экспозиция - 1 ч.

264

-добавление во все лунки по 0,025 мл диагностикума холерного эритроцитарного О-иммуногло- булинового 0,6% концентрации.

•Учет результата через 2–3 ч (можно на следующее утро); за титр вибриоцидных антител принимают последнюю лунку, в которой отсутствует гемагглютинация (эритроциты выпадают на дно лунок в виде «пуговки»).

Определение токсиннейтрализующих антител (проба Крейга)

Примечания:

-начать работу с посева агаровой культуры V. cholerae eltor в пробирку МПБ для получения 3-часовой культуры.

-занятие проводится в виде объяснения курсантам методики постановки пробы Крейга и демонстрации положительной и отрицательной реакции на кролике.

7.4. Приложение Реакция иммобилизации вибрионов

Чувствительность метода иммобилизации вибрионов под влиянием холерной О1-сыворотки 4,3·105 м.к. в 1 мл. На предметное стекло наносят 2 капли исследуемого материала (испражнений, верхнего слоя I-ой или II-ой средыобогащения).Первуюкаплюнакрываютпокровным стеклом (контроль), ко второй добавляют каплю холерной 01-сыворотки в разведении 1:50, перемешивают и накрывают покровным стеклом. Раздавленные капли смотрят под микроскопом при увеличении 400600х, используя фазово-контрастное устройство или конденсор темного поля.

При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов в первой капле наблюдают характерную под-

265

вижность, во второй – подвижность вибрионов прекращается немедленно или в течение 1-2 мин.

Для определения принадлежности холерных вибрионов к серовару можно пользоваться сыворотками Инаба и Огава в разведении 1:50. Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15-20 мин от начала исследования нативного материала. При отрицательном результате исследование повторяют после подращивания в 1% пептонной воде.

В случае отрицательного результата необходимо провести аналогичное исследование с холерной сывороткой О139 серогруппы, которую разводят 1:5.

Тесты дифференциации биоваровV. cholerae О1 серогруппы

Определение чувствительности к диагностическим холерным фагам

В лабораторной диагностике холеры используют бактериофаги диагностические холерные классический и эльтор. При оценке результатов проб с фагами необходимо ориентироваться на диагностический рабочий титр (ДРТ), которыйобычно обозначают на этикетках. Определение чувствительности к фагам проводят как с цельными препаратами, так и с их 10-кратными разведениями до ДРТ в мясо-пептонном бульоне. Дифференциальный рабочий титр не ниже 1x10-2.

Для постановки реакции в чашки разливают щелочной агар. После застывания агара и подсушивания его в течение 30 мин при 37°С дно чашек делят на квадраты по количеству образцов фагов и 10-кратных разведений фага. В пробирку с 5 мл 0,5-0,7% питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45°С, добавляют 0,1-0,2 мл 3-4-часовой бульонной культуры, тща-

266