6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

ся бесцветными, а колонии спорообразующих сапрофитов окрашиваются в розовый или красный цвет.

•Изучение способности к капсулообразованию: из культур, выращенных на капсулообразующих средах в СО2-инкубаторе, приготовление мазков и окрашивание по методу Гинса.

•Изучение чувствительности к пенициллину:

а) посев стандартной бактериологической петлей суточные бульонные культуры на чашки МПА, содержащие 10 и 50 ЕД/мл пенициллина в 1 мл среды; б) постановка теста «жемчужное ожерелье» мето-

дом Груз (приложение); в) постановка теста «жемчужное ожерелье» мето-

дом посева на чашки МПА с пенициллином. Контроль - агар без пенициллина.

•Изучение чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу. При постановке пробы с фагом используют 3-6-часовую бульонную культуру, которую наносят пипеткой на пластинчатый МПА и в центр подсохшей капли петлей наносят бактериофаг. Учет через 6-24ч.

Примечания:

-работа начинается с посева культур в пробирку с МПБ и в пробирку МПБ с 0,5 ЕД/мл пенициллина для постановки теста «жемчужное ожерелье»:

-посевывжелатинеоставляют при комнатной температуре.

Занятие 3.

ИзучениебиологическихсвойствB.anthracisиB.сereus

•Регистрация чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу.

307

•Регистрация чувствительности к пенициллину (рост на агаре с пенициллином в концентрации 10 и 50 ЕД/мл).

•Изучение протеолитической активности (характер роста в желатине).

•Изучение способности к спорообразованию:

а) приготовление мазков из 3-суточных агаровых культур; б) окрашивание мазков по методу Пешкова или

другим способом.

•Обеззараживание всех имеющихся в наличии культу;

•Заполнение журналов движения культур и учета ПБА, находящихся в рабочей коллекции

•Составление акта на уничтожение культуры возбудителя сибирской язвы.

9.2. Лабораторный диагноз

Современная лабораторная диагностика сибирской язвы включает бактериоскопический, бактериологический, биологический, аллергический и серологический методы.

Лабораторное исследование при сибирской язве проводят с целью выявления возбудителя, фрагментов ДНК или специфических антигенов от больного человека (содержимое везикул, карбункулов, отделяемое язв, струп, мокрота, кровь), из органов павших животных, кожевенного сырья, шерсти и объектов окружающей среды (почва, вода, смывы, сточные воды, воздух и т.д.). Материал от больных людей, из объектов окружающей среды, сырье животного происхождения забирают в стерильные пробирки, банки или другую лабораторную посуду. Кровь для исследования берут из вены в пробирку, засевают в питательную среду и делают два тонких мазка на предметных стеклах. Материал

308

следует отбирать так, чтобы полностью исключить возможность рассеивания заразного начала. С соблюдением строжайших мер предосторожности, согласно ветеринарной инструкции Министерства сельского хозяйстваот5июня1981г.№115/6А«Омероприятиях против сибирской язвы», можно произвести отсечение уха у трупа животного с той стороны, на которой оно лежит, и направить его на исследование. Для этого ухо крепко перевязывают выше и ниже предполагаемой линии среза, место среза прижигают. Ухо заворачивают в пергаментную бумагу и полиэтиленовую пленку, упаковывают в металлическую коробку или ящик.

Сырье животного происхождения (шерсть, волосы, щетина) направляют для исследования в количестве не менее 30 г. Почву отбирают в количестве 50-70 г на пробу, воду на исследование направляют в объеме не менее 1 л. Отбор проб воздуха в количестве 50250 л производят с помощью приборов Кротова, Дьяконова, Речменского, Киктенко, каскадных импакторов.

Смывы с объектов окружающей среды рекомендуется брать тампоном, смоченным 0,9% раствором хлористого натрия, и помещать в стерильную посуду с плотно закрывающейся крышкой.

На объекты, подлежащие исследованию, составляют сопроводительный документ с указанием места, времени, даты забора и подписи взявшего материал. В лабораторию анализы направляют в пломбированных или опечатанных герметических деревянных или железных ящиках с нарочным.

Из исследуемого субстрата готовят несколько мазков. Окраску производят по Граму (на вегетативные клетки) и Пешкову (на споры). Бактериоскопию сочетают с люминесцентно-серологическим анализом. В мазках споры выявляются в виде овальных или круглых об-

309

разований, окрашенных в голубой или синий цвет. В мазках от больного или трупа человека и животных возбудитель сибирской язвы определяется в виде характерных крупных палочек, окруженных капсулой (окрашивание по Гинсу). По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.

Не загрязненный посторонней микрофлорой патологический материал от больного засевают на МПА и в пробирки с МПБ.

Загрязненный материал (кусочки органов трупа, мокроту, испражнения, кожу, шерсть, зерно, фураж, почву, мясные продукты, щетину) заливают 5-10-крат- нымколичествомстерильнойводыили0,9%раствором хлористого натрия. Полученную взвесь разливают в две пробирки. Одну пробирку с материалом прогревают на водяной бане при 65 ºС в течение 30 мин с целью уничтожения вегетативных форм.

Подготовленный для исследования материал (не прогретыйипрогретый)засеваютначашкисМПА;МПА, содержащим 5% дефибринированной крови барана; МПА, содержащим 0,01% ФФФ. Посевы помещают в термостат при температуре 37 ºС.

Исследуемым материалом заражают биопробных животных (белых мышей и морских свинок) подкожно или внутрибрюшинно по 0,2-0,5 мл. Наблюдение за опытными животными длится до 10 дней, если они не пали. Павших животных вскрывают немедленно, производят посевы инфильтрата из места инъекции, крови и органов (сердце, селезенка, печень) на питательные среды, делают мазки, окрашивают их по Граму, одним из методов для выявления капсулы и антисоматической люминесцирующей сывороткой, отмечают патологоанатомические изменения. В положительном

310

случае в мазках обнаруживают вегетативные клетки в виде коротких цепочек, отдельные микробные клетки, окруженные капсулой и специфически светящиеся клетки типичной морфологии при МФА. При вскрытии животных, павших от сибирской язвы, отмечают увеличенную селезенку, гиперемию внутренних органов, несвернувшуюся кровь. Наместевведенияматериала наблюдаются различной величины студенистый геморрагический отек. Животных, выживших после 10-дневного срока наблюдения, исследуют в полном объеме.

После 20-часовой инкубации посевов исследуемого материала или органов биопробных животных отбирают колонии для дальнейшей идентификации. В первую очередь исследуют колонии, имеющие морфологию, характерную для возбудителя сибирской язвы. В случае отсутствия «подозрительных» колоний с каждого посева следует отбирать и изучать не менее 10 любых шероховатых колоний. Колонии отсевают на МПАиМПБ.Культуруидентифицируютпоосновным (проба со специфическим сибиреязвенным фагом, тест «жемчужного ожерелья», способность к капсулообразованию) и дополнительным (гемолитическая, фосфатазная и лецитиназная активность, специфическая флуоресценция) тестам.

У выделенной культуры B. anthracis определяют DcL для кроликов и DL50 для морских свинок и белых мышей. Для сокращения сроков бактериологического анализа предложен ускоренный биологический метод обнаружения возбудителя сибирской язвы. Согласно этому методу, исследуемый материал вводят внутрибрюшинно шести белым мышам по 0,5 мл. Через 1 и 2 ч вскрывают по паре мышей, из перитонеального экссудата и крови сердца делают мазки, из селезенки и печени - мазки-отпечатки. Мазки окрашивают одним из

311

методов на обнаружение капсулы и капсульно-сомати- ческой люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Параллельно производят посевы на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя. Оставшуюся пару мышей наблюдают до 10 суток. Реакцию термопреципитации Асколи используют в случаях, когда трудно рассчитывать на выделение чистой культуры возбудителя: при исследовании шерсти, шкур, щетины, войлока, овчины, костной муки и прочих объектов, а также при начавшихся явлениях трупного разложения и т.д. Реакция основана на обнаружениитермостабильныхантигеноввозбудителя,которые сохраняются гораздо дольше, чем жизнеспособные вегетативные клетки. Реакция Асколи позволяет быстро обнаружить сибиреязвенный антиген. Тем не менее, эту реакцию нельзя признать строго специфичной, поскольку полисахаридный антиген возбудителя сибирской язвы вступает в реакцию с преципитирующими сыворотками против близкородственных ми-

кроорганизмов (B. cereus, B. subtilis).

При люминесцентной микроскопии, проводимой с использованием антисоматической или антиспоровой люминесцирующих сывороток, возбудитель обнаруживается в вегетативной или споровой формах. При специфической реакции наблюдается яркое свечение периферии клеток (спор), имеющих характерную морфологию. Чувствительность метода высока и колеблется в пределах сотен тысяч микробных тел в одном миллилитре материала.

Для текущей и ретроспективной диагностики сибирской язвы у человека используют аллергическую пробу с антраксином. Последний вводят в дозе 0,1 мл внутрикожно на внутреннюю поверхность левого предплечья обследуемого. Результат учитывают через

312

24-48 ч. Положительная реакция проявляется с первых дней заболевания в виде гиперемии и инфильтрата на месте введения и оценивается в зависимости от размера этих элементов.

В последнее время в практику лабораторных исследований, в том числе при сибирской язве, широко внедряются современные методы генетики и молекулярной биологии. Для типирования штаммов B. anthracis можно использовать величину мол% ГЦ, гибридизационный анализ, различные методы так называемого фингерпринтинга ДНК и РНК, которые методически основываются на рестрикционном анализе, гибридизационных пробах и ПЦР.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ Исследование материала от больного и почвы и кожсырья на обнаружение возбудителя сибирской язвы

Занятие 4 Исследование содержимого карбункула больного

•Приготовление мазков для окраски по Граму и сибиреязвенной люминесцирующей сывороткой.

•Посев исследуемого материала на 2 чашки МПА с целью получения изолированных колоний.

•Постановка пробы на белых мышах (ввести подкожно двум белым мышам по 0,3 мл содержимого карбункула).

Исследование почвы

•Приготовление взвеси почвы в 0,9% растворе хлористого натрия (1:10).

•Обработка ½ части полученной взвеси термическим методом:

Прогревание проводят на водяной бане при 65°С в

течение 30 мин. Прогретый материал является ис-

313

ходным для посева на питательные среды и заражения биопробных животных.

•Посев обработанной и необработанной почвы на 2 чашки МПА, 2 чашки 5% кровяного агара и 2 чашки МПА с 0,01% ФФФ с целью получения изолированных колоний.

•Постановка биопробы на белых мышах (введение подкожно двум белым мышам по 0,3 мл суспензии термически обработанной почвы).

Занятие 5

Продолжение исследования содержимого карбункула больного: выделение чистой культуры

•Просмотр роста на чашках МПА.

•Отбор подозрительных колоний, проверка их мазком с окраской по Граму, посев на сектора чашки с 5%-ным кровяным агаром и в МПБ.

•Вскрытие павших биопробных животных, зараженных содержимым карбункула больного.

а) описание патологоанатомической картины, заполнение протокола; б) посев органов (печень, лимфатический узел, се-

лезенка) на чашку МПА, кровь - в МПБ; в) приготовление трех мазков: для окраски по Граму,

люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой, для обнаружения капсулы по методу Бурри-Гинса.

Продолжение исследования почвы: выделение чистой культуры

•Просмотр роста на чашках с посевами нативного материала.

•Отбор подозрительных колоний под контролем мазка с окраской по Граму.

•Посев колоний на сектора 5% кровяного агара и в МПБ.

•Вскрытие павших биопробных животных, заражен-

314

ных суспензией обработанной почвы:

а) описание патологоанатомической картины, заполнение протокола; б) посев органов (печень, селезенка) и лимфатиче-

ского узла на чашку с МПА, кровь - в МПБ; в) приготовление трех мазков для окраски по Гра-

му, люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой, для обнаружения капсулы одним из методов.

Примечание: при отсутствии роста культур в посевах из нативного материала провведение выделения чистой культуры от биопробных животных.

Занятие 6.

Идентификация культур, выделенных из карбункула больного и почвы

•Просмотр посевов на секторах 5% кровяного агара и МПБ. Проверка культуры на чистоту роста в мазках, окрашенных по Граму.

•Проверка выделенных культур на чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу.

•Посев каждой культуры в желатин уколом, в 0,3% ПЖА, на жидкую среду с желтком или на чашку МПА с желтком, на среду Леффлера, на чашку МПА с ФФФ, на МПА, содержащий 10 и 50 ЕД/мл пенициллина, на скошенный МПА.

•Постановкатеста«жемчужноеожерелье»(приложение): а) на плотной питательной среде с пенициллином 0,5 и 0,05 ЕД/мл;

б) методом Груз (приложение).

•Изучение чувствительности культуры, выделенной из карбункула больного, к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков (табл. 20).

Таблица 20

315

Пограничные критические значения диаметров зон задержки роста для определения чувствительности к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков

		Содержание	Пограничные значения диаметров зон
			задержки роста штаммов (мм)
	Антибиотик	антибиотиков в
			резистент-	промежу-	чувстви-
		диске в мкг
			ных	точных	тельных
	Бензилпенициллин	6	≤ 10	11-16	≥ 17
	Гентамицин	10	≤ 15	-	≥16
	Тетрациклин	30	≤ 16	17-21	≥ 22
	Эритромицин	15	≤ 17	18-21	≥ 22

Примечания:

-посевы культур в желатине - при комнатной температуре;

-за 3 ч до предлагаемой работы отсев изучаемых культур на МПБ и МПБ с пенициллином.

Исследование кожсырья в реакции Асколи

•Подготовка материала для реакции Асколи:

•Измельчение обеззараженного кожевенного сырья, добавление 0,9% раствора хлористого натрия 1:10, настаивание на холоде при 4 ºС в течение 18-48 ч.

Занятие 7

Идентификация культур, выделенных из карбункула больного и почвы

•Регистрация протеолитической активности и характера роста в желатине.

•Учет пенициллиназной, лецитиназной, фосфатазной активности на чашках МПА с пенициллином, МПА с желтком (жидкой желточной среде) и на МПА с 0,01% ФФФ.

•Учет пробы с сибиреязвенным бактериофагом.

•Учет результатов изучения чувствительности куль-

316