6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

Занятие 11.

Контроль питательных сред на чуму

•Просмотр посевов на пластинчатом агаре, регистрация величины и количества колоний.

•Регистрация появления видимого роста в бульоне.

•Оценка качества сред с генцианвиолетом. Подбор

для работы ингибирующего разведения генци - анвиолета.

Занятие 12. Бактериологическийконтрольпитательныхсредначуму

•Подсчет колоний па пластинчатом агаре.

•Регистрация наличия роста в бульоне.

•Заключение о пригодности сред.

•Обеззараживание посевов.

Лабораторная диагностика чумы у человека

Лабораторные исследования на чуму проводят специализированные лаборатории, имеющие лицензию на данный вид деятельности.

Объектами для исследования от людей (больных, контактных) и трупов являются:

-отделяемое язвы или пунктат из карбункула, везикулы (кожная форма);

-содержимое бубона (бубонная форма);

-мокрота, слизь из зева и мазок с миндалин (легочная форма); -испражнения (кишечная форма);

-кровь (все формы);

-в зависимости от поражений отдельных органов

исистем - моча при наличии в ней крови, спинно - мозговая жидкость - при менингиальных явлениях

(табл. 25).

347

Таблица 25

	Способы забора материала
	Материал	Способы забора
		Забирают стерильно шприцем емкостью не менее 5
		мл. Пораженный участок и окружающую его ткань
		обрабатывают 70°-ным этиловым спиртом, затем
		5%-ным раствором йода и вновь спиртом. Иглу осто-
		рожно вводят с таким расчетом, чтобы ее острие до-
	Пунктат из бубона	стигло центральной части бубона. Затем, оттянув
		до отказа поршень, медленно вытягивают иглу. По-
		сле извлечения иглы из бубона через нее набирают
		в шприц 0,5 мл стерильного питательного бульона,
		содержимое выливают в стерильную пробирку и за-
		крывают резиновой пробкой.
	Содержимое вези-	Иглу вводят у края образования и медленно продви-
	кулы (пустулы)	гают в центр.
	Пунктат из язвы и	Пунктируют плотный край.
	карбункула
	Вскрывшийся бубон	Забирают материал отдельно из периферической
		плотной части и отделяемое свища.
	Слизь из зева	Забирают стерильным ватным тампоном.
	Мокрота	Забирают в стерильную широкогорлую стеклянную
		банку с притертой пробкой или крышкой.
	Испражнения	То же.
	Моча	То же.
		10 мл крови берут стерильным шприцем и 5 мл засе-
	Кровь	вают у постели больного во флакон с 50 мл бульона и
		на чашки с плотной питательной средой.
	От трупа кусочки	Забирают в стерильные широкогорлые стеклянные
	пораженных орга-
		банки с притертыми пробками или крышками.
	нов

Посевы взятого материала желательно проводить у постели больного. Время от момента взятия материала и до начала его исследования не должно превышать 5-6 ч, если нет условий для хранения его на холоде. С целью сохранения материала можно использовать транспортную среду Кери-Блэра, консерванты Берлина и Башевой, жидкость Брокэ.

Лабораторное исследование на чуму начинается одновременно бактериоскопическим, бактериологи-

348

ческим, биологическим, иммуносерологическим и генетическим методами. Наряду с классической схемой лабораторного исследования выполняются экс- пресс-методы, позволяющие дать предварительный положительный ответ в течение 2-5 ч от начала исследования материала. К методам экспресс-диагностики относятся: иммунофлуоресцентный анализ, ПЦР, им- муно-суспензионные методы: система 2-3-компонент- ных реакций с эритроцитарными диагностикумами, иммуноферментный анализ, дот-иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ. Все экспресс-методы выполняются только после обеззараживания материала. Экспресс-методы используют на всех этапах исследования материала (нативный материал, после подращивания, материал от «биопробных» животных, при идентификации культуры).

Из доставленного материала готовят мазки с окраской по Граму и метиленовым синим. При обнаружении первых случаев заболеваний подозрительных на чуму или трупа человека готовят не менее 6-8 мазков (один окрашивают метиленовым синим, второй – по Граму, третий – чумной люминесцирующей сывороткой, остальные оставляют неокрашенными для повторных исследований). Наличие типичных для заболевания чумой клинических проявлений и обнаружение в мазках биполярных грамотрицательных палочек овоидной формы дает право поставить предварительный диагноз - подозрение на чуму. Выявление специфически светящихся микробов, окрашенных чумной люминесцирующей сывороткой, подтверждает предварительный ответ.

Для посева необходимо использовать среды, имеющие регистрационное удостоверение Росздравнадзора и разрешенные к применению в РФ. Из отечественных

349

сред – питательная среда для выделения и культивирования чумного микроба сухая, выпускаемая ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора», и среды зарубежногопроизводства,разрешенныекприменениюсогласно методическим рекомендациям (МР 02.0-06) РосНИПЧИ «Микроб» производства компании HiMediaLaboratoriesPvtLtd.

Незагрязненный посторонней микрофлорой материал (пунктат из бубона, карбункула, содержимое пустулы, везикулы, кровь и т.д.) засевают на плотные и жидкие питательные среды. Материал, содержащий постороннюю микрофлору (мокрота, слизь из зева, вскрывшийся бубон, содержимое язвы), засевают на плотные среды с ингибитором посторонней микрофлоры. Пунктат из бубона, везикулы наносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой на чашку агара и распределяют его шпателем или петлей частыми штрихами, оставшийся материал вносят в пробирку с бульоном.

Жидкую мокроту (особое внимание уделяют участкам с прожилками крови) петлей (2-3 петли) или пастеровской пипеткой с широким капилляром наносят на поверхность агара, растирают шпателем или частыми штрихами петлей. Затем без обжигания переносят на вторую и третью чашки плотного агара. Если мокрота вязкая, то ее комочек захватывают стерильным пинцетом, переносят на поверхность агара и тщательно растирают шпателем или частым штрихом бактериологической петлей сначала в первой, затем во второй чашке. Слизь из зева засевают ватным тампоном, остатки материала промывают в 1мл жидкой питательной среды и используют для заражения биопробных животных. Сгусток крови (если посев не сделан у постели

350

больного) из пробирки осторожно переносят в чашку Петри, разрушают его целостность стерильными препаровальными иглами, затем жидкую часть крови набирают в пипетку, засевают во флаконы с бульоном и 0,1 мл - на агаровую пластину, рассевая частым штрихом. Посевы инкубируют в термостате при 28°С, а для обнаружения фракции FI - при 37°С.

В первый день исследования с нативным материалом целесообразно ставить пробы с чумным бактериофагом ускоренным методом (приложение) и на чувствительность к антибактериальным препаратам дискодиффузионным методом (прямым посевом нативного материала сплошным газоном на чашку Петри). Это позволит при значительном числе клеток возбудителя чумы в материале получить результат чувствительности к антибиотикам через 20-24 ч с момента исследования, а не через 36-40 ч, как при постановке пробы на чувствительность к антибиотикам стандартизированным методом. Для выбора антибиотиков необходимо обратиться к схемам применения антибактериальных препаратов при экстренной профилактике чумы.

Биологическая проба является обязательной, так как не только повышает вероятность выделения культуры, но и необходима для ее идентификации. Ставят на морских свинках и/или белых мышах. Метод введения исследуемого материала зависит от характера материала. Незагрязненный материал вводят животным подкожно (0,5 мл морским свинкам и 0,2 мл белым мышам) или для ускорения гибели биопробного животного - внутрибрюшинно (0,5-1,0 мл морским свинкам и 0,3-0,5 мл белым мышам). Мокротой, слизью из зева,гноемизоткрытогоабсцессазаражаютнакожным методом. В зависимости от метода введения, животное погибает на 3-9-й день. Ускорить постановку диагно-

351

за позволяет введение части биопробных животных (1 морской свинке и 1 белой мыши) гидрокортизона за 2 ч до заражения в дозе 5 мг (в 0,5 мл 0,85%-ного хлористого натрия) под кожу области бедра. Животных с пониженной резистентностью вскрывают на первые сутки - одну белую мышь, на третьи сутки – морскую свинку. Остальных вскрывают на шестые сутки. Чувствительность биопробных животных также можно повысить, если исследуемый материал ввести с желтком куриного яйца. У животных, погибших от чумы

врезультате подкожного или накожного заражения,

вместе введения наблюдают полнокровие, серозногеморрагическое пропитывание тканей, нагноение, некроз. Лимфатические узлы увеличены, гиперемированы, часто инфильтрированы геморрагическим экссудатом, могут быть плотными или размягченными, окружающие ткани пропитаны студневидной се- розно-геморрагической или гнойно-геморрагической жидкостью. В тканях узла могут быть очаги некроза или нагноения. В селезенке, печени, легких наблюдаютсяединичныеилимножественныеузелкисероватого цвета. Узелки могут быть точечными или достигать величины булавочной головки. Вокруг некоторых из них наблюдаются венчики гиперемии. В легких могут быть очаги кровоизлияния и участки уплотнения темно-красного или серовато-красного цвета. Селезенка, печень, надпочечники увеличены, дряблой консистенции, полнокровны, с участками некроза. Иногда в брюшной полости имеется вязкий экссудат. При накожном заражении на месте введения часто наблюдаются мелкие везикулы, окруженные зоной гиперемии, или язвочки. При внутрибрюшинном заражении развивается экссудативный перитонит с образованием фибринозно-гнойных пленок на капсуле селезенки и

печени.

От погибшего животного (паренхиматозных органов, лимфатических узлов и крови) делают мазки-отпечат- ки, производят посевы на среды, готовят суспензию для заражения второго биопробного животного и исследования на наличие фракции I чумного микроба. Выживших животных умерщвляют на 7 сутки и производят патологоанатомическое, бактериологическое и серологическое исследования.

Для обнаружения в нативном материале фракции I возбудителя чумы ставят реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с иммуноглобулиновым и реакцию нейтрализации антител (РНАт) с антигенным эритроцитарными диагностикумами или иммунофлуоресцентный анализ с использованием чумной люминесцирующей сыворотки.

Ускоренный метод генодиагностики выполняется в течение 5-6 ч. Высокая разрешающая способность метода (1000 м.к./мл) позволяет использовать его, прежде всего, при исследовании нативного материала. Реакция выполняется на тест-системах «Ген Пест» для выявления ДНК Y. pestis методом полимеразной цепной реакции производства РосНИПЧИ «Микроб». Для постановки мультиплексной ПЦР используют праймеры, обеспечивающие специфичную амплификацию фрагментов ДНК двух генов-cafI и pla, локализованных на собственных плазмидах чумного микроба pFra и pPst, соответственно. На основании выделения в пробе ДНК возбудителя чумы (одной или двух плазмид) дается устный предварительный положительный ответ. Через 18-24 ч. Изучают рост на плотной и жидкой питательных средах. При наличии типичного роста в бульоне делают мазки: окрашивают по Граму и метиленовым синим. С плотной питательной среды отбирают

353

типичные колонии с целью выделения чистой культуры и ее идентификации. Учитывают результаты постановки пробы с чумным бактериофагом ускоренным методом. При сомнительном результате на 2-3 подозрительные колонии наносят чумной бактериофаг. После инкубации в термостате в течение 10-12 ч проводят учет результатов пробы с чумным бактериофагом. Лизис колоний под действием чумного бактериофага подтверждает положительный ответ.

Учитывают результаты чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом.

Через 36-48 ч. Выделенную культуру идентифицируют на основании следующих признаков:

1)характерная морфология микроба (микропрепараты из нативного материала и чистых культур);

2)характерная морфология роста на плотной и жидкой питательных средах;

3)чувствительность к чумному бактериофагу;

4)специфическое свечение при люминесцентной микроскопии чистой культуры;

5)наличие специфического для возбудителя чумы антигена фракции FI, выявленного в РПГА или РНАт;

6)ферментативная активность (глицерин, мочевина, рамноза, сахароза, глюкоза и др.);

7)одновременно с идентификацией проводят определение чувствительности к антибиотикам стандартизованным дискодиффузионным методом и методом серийных разведений в агаре или бульоне.

Через 60-72 чпроизводят учет результатов идентификации по следующим тестам:

- чувствительность к чумному бактериофагу и антибиотикам;

- наличие FI, выявленной методом флуоресцирующих антител и в РПГА-РНАт.

354

Для дальнейшей дифференциации выделенной культуры ставят тест на наличие пестицин-фибринолизин- плазмокоагулазной активности и ПЦР для детекции плазмид pFra и pPst.

Диагноз чумы у человека ставится на основании выделения у него культуры возбудителя чумы и ее идентификации, а так же при обнаружении специфического для чумного микроба антигена FI и специфических антител к антигену FI в сыворотках больных и переболевших.

Занятие 13.

Лабораторная диагностика чумы у человека

Исследование мокроты больного.

•Подготовка мазков из мокроты, обработка части из них люминесцирующей сывороткой, смешанной с альбумином, меченым родамином, и части мазков - окрашивание по Граму.

•Посев мокроты на 2 чашки агара с генцианвиолетом переносом.

•Постановка пробы на чувствительность к антибиотикам ускоренным диско-диффузионным методом.

•Постановка ориентировочной пробы с бактериофагом Л-413С ускоренным методом.

•Постановкабиопробынаморскойсвинкенакожным методом (н/к) и белой мыши подкожно (п/к).

•Исследование крови больного.

•Приготовление мазков, окрашивание по Граму, синькой Леффлера и обработка люминесцирующей сывороткой, смешанной с альбумином, меченым родамином.

•Посев крови больного в ПБ.

•Посев крови на 2 чашки с ПА, на одну из чашек нанести бактериофаг Л-413С (методом «стерильного

355

пятна»).

•Постановка пробы на чувствительность к антибиотикам ускоренным дискодиффузионным методом.

•Постановка биопробы на морской свинке и белой мыши подкожным или внутрибрюшинным методами.

Примечание: биопробных животных вскрывают тотчас после гибели. Выжиыших животных вскрывают через 6-7 суток.

Лабораторная диагностика чумы у носителей

Материал для исследования: грызуны, зайцеобразные, насекомоядные и наземные хищники, трупы мелких млекопитающих, остатки пищи из гнезд хищных птиц, материал от больных и павших верблюдов. В отдельных случаях исследуют материал от сайгаков, погадкихищныхптиц,экскрементыгрызуновихищников. Животных, добытых живыми, умерщвляют прямо у капкана с помощью корнцанга. Трупы помещают в бязевыемешочки,которыеплотнозавязывают,снабжают этикетками, складывают в металлические отсадники, ящики или клеенчатые мешки. Кратковременное хранение материалаосуществляют в прохладном месте. Живых грызунов помещают в отсадники, металлические ящики или ящики, обитые изнутри жестью, и дустируют. Ящики должны быть снабжены решетчатой крышкой.

Полевой материал доставляют в лабораторию в предельно короткие сроки, желательно в первой половине дня. К работе с полевым материалом приступают сразу после его поступления, однакодопускается кратковременное его хранение (не более 20 ч) в помещении с низкой температурой (рефрижератор, ледник и др.).

Трупы животных после очеса погружают в 3%-ный мыльный раствор или другое моющее средство, за-

356