6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

туры от больного к антибиотикам (табл. 20).

•Приготовление мазков для определения капсулы у культур, выращенных в СО2-инкубаторе на среде Леффлера.

•Заполнение паспорта на выделенные культуры.

•Передача всех посевов выделенных культур для обеззараживания.

Постановка реакции Асколи

•Фильтрование полученного экстракта до полной прозрачности через асбестовую вату или бумагу.

•Постановка реакции Асколи.

Занятие 8.

Исследование материала от больного для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы при помощи метода ПЦР

Материал от больного - содержимое карбункула - отбирают (с соблюдением правил забора клинического материала) стерильной платиновой петлей или пастеровской пипеткой в количестве 0,1-1,3 мл. Кожные элементы предварительно очищают ватным тампоном, смоченным спиртом или эфиром. Материалом для исследования могут быть также пробы из внешней среды - почва, смывы с поверхностей, а также суспензии органов павших животных и клеточные взвеси (106-108 м.к./ мл) при идентификации выделенных культур.

Для обеззараживания материала, содержащего спорообразующие микроорганизмы­ , в том числе B. anthracis, применяют методический подход, заключающийся в герминации спор и последующей обработке пенициллином­ ,прогреваниемивоздействиилизирующего буфера с гуанидинтиоционатом­ . Принцип метода состоит в прорастании спор в вегетативные клетки при культивировании их в благоп­ риятных условиях.

317

Далее под действием температуры и пенициллина происходит разрушение клеточной мембраны бацилл с высвобождением ДНК. Последовательность выполнения операций следующая:

1.Для герминации спор исследуемый материал засевают в количестве 0,1 мл в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера рН 7,6 и инкубируют с встряхиванием при температуре 37°С в течение 2,5 ч.

2.В пробирки с материалом добавляют пенициллин в расчете 1000 ЕД/мл, инкубируют при 37°С в течение 15 мин, затем прогревают на водяной бане при температуре 100°С в течение 10 мин.

3.Из проб отбирают по 100 мкл материала в микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф, добавляют по 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом

и прогревают при температуре 65°С в течение 15 мин. После выполнения процедур 1-3 этапов материал для исследования считается обеззараженным, при этом не повреждается ДНК и в последующем не ингибируется ПЦР. Для выделения ДНК из материала, обеззараженного как описано выше, используют набор реагентов, производимый РосНИПЧИ «Микроб», или аналогичный (НПФ «Биоком», «ДНК-технология» или ЗАО «ВекторБест»).

Для постановки ПЦР используется тест-система для выявления ДНК B. anthracis рХО1, выпускаемая РосНИПЧИ «Микроб». Видоспецифичные праймеры выбраны на основе нуклеотидной последовательости гена pag, кодирующего протективный антиген токсинного комплекса и локализованного на плазмиде рХО1. Тест-систему извлекают из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок (для этого лучше использовать ледяную баню или охладитель проб). После траспортировки или длительного хранения пробирки

318

центрифугируют 20 сек (для осаждения капель со стенок) и тщательно перемешивают на вортексе. Готовят реакционную смесь в специально предназначенной для этого пробирке из расчета на одну пробу: 10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл, раствор дНТФ - 2,5 мкл, праймеры ВА1 и ВА2 - по 1 мкл, Таq-полимераза - 0,2 мкл, вода деионизованная - 7,8 мкл.

Фермент в реакционную смесь вносят в последнюю очередь и оставляют его вместе с наконечником в пробирке. Затем в наконечник вставляют дозатор, настроенный на 15 мкл, реакционную смесь тщательно перемешивают не только круговыми движениями наконечника, но и поступательными движениями поршня дозатора (пипетированием). По окончании перемешивания в каждую пробирку, включая контроли, добавляют по 15 мкл реакционной смеси, после чего вносятпооднойкаплевазелиновогомасла(дляпредотвращения испарения реакционной смеси при термоциклировании.). В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль (-), вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирку, обозначенную как положительный контроль (+), - 10 мкл контрольной ДНК (специально предназначенным для этого дозатором!). Пробы в объеме 10 мкл вносят (также предназначенным для этого дозатором) под минеральное масло. По мере заполнения пробирки закрывают, нумеруют, помещают в амплификатор и термоциклируют по программе: предварительная денатурация при 94ºС (1 цикл) - 3 мин, затем 35 40-секундных циклов при 94, 49 и 72ºС. В заключение проводят 1 цикл при 72ºС в течение 10 мин. После первого этапа амплификации для повышения чувствительности и специфичности реакции проводят вторую стадию. Реакционную смесь готовят из расчета на одну пробу: 10х буфер - 2,5 мкл, раствор дНТФ

319

- 2,5 мкл, праймеры ВА3 и ВА4 - по 1 мкл каждого, фермент Taq-полимераза - 0,2 мкл, вода деионизованная - 16,8 мкл. Далее реакциионную смесь разливают по 24 мкл в каждую пробирку, наслаивают на нее по одной капле вазелинового масла и под масло вносят по 1 мкл амплификата, полученного после первого этапа реакции. Термоциклирование на втором этапе проводят по следующей программе: 1 цикл - 1 мин при 94ºС, 25 40-секундных циклов при 94, 49 и 72ºС и 1 цикл при 72ºС в течение 10 мин.

Наиболее простой метод выявления продукта ферментативной амплификации ДНК в ПЦР - электрофорез в агарозном геле. По окончании программы амплификации анализируемые образцы смеши­вают с 2,0-2,5 мкл раствора для нанесения проб и вносят в лунки горизонтального агарозн­ ого геля. Для более четкого разделения амплифицированных фрагментов целесообразно использование агарозного геля плотностью 1,3%. Электрофорез проводят в 1хТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концент­ рации 0,5 мкг/мл при напряженности 6 В/см в течение 1 ч, не допуская выхода бромфенолового синего из геля. Затем гель просматривают в ультрафиолетовом свете на транс-иллюминаторе и результат фоторегистрируют­ . Амплифицированные фрагменты ДНК идентифици­ руют по размеру, сравн­ ивая флуоресцирующие в геле полосы анализируемых образцов с полосами положительн­ ого контроля или в соответствии с маркерами молекулярного веса.

Оценка результатов ПЦР:

-положительный контроль - выявляется полоса фрагмента 154 п.н.;

-отрицательный контроль - полоса на уровне положительного контроля отсутствует

320

-анализируемые пробы: наличие полосы на уровне положительного контроля (154 п.н.) указывает на присутствие ДНК возбудителя в исследуемом материале,

-наличие полос выше или ниже положительного контроля является неспецифичным ответом и во внимание не принимается.

9.3. Приложение Режим работы с бактериями, образующими споры

Вся работа с культурами возбудителя сибирской язвы и зараженными животными должна проводиться в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

При работе с возбудителем сибирской язвы для дезинфекции применяют 3-6% растворы Н2О2. Для снижения высокого поверхностного натяженияН2О2 в ее растворы добавляют моющие средства до 0,5% концентрации. Повышение температуры смеси до 50-60 оС значительно усиливает бактерицидную активность Н2О2 в отношении микроорганизмов и позволяет снизить экспозицию 6% раствора с 6 ч до одного часа. Приготовление рабочих растворов и активацию производят в резиновых перчатках, предохранительных очках, 4-слойной марлевой маске.

Кроме вышеперечисленных веществ, для дезинфекции применяют растворы велтолена, формалина, едкого натра, септодора-форте и др.

В лаборатории основным методом обеззараживания объектов, инфицированных возбудителем сибирской язвы, является автоклавирование при температуре 132±2 ºС под давлением 2,0 кгс/см2 в течение 90 мин. Эффективность автоклавирования контролируется

321

физическим, бактериологическим, химическим методами. Физический метод контроля - непосредственное наблюдение за процессом стерилизации по показаниям термометра, манометра. Бактериологический контроль осуществляется с помощью тест-объектов. В качестве тест-объектов используется отмытый стерильный песок, пропитанный термофильными бактериями «С». Пробирки с тест-объектами (не менее 6 штук) помещают на разных уровнях в автоклав. Одна пробирка остается контрольной. После прохождения цикла автоклавирования все пробирки стерильно заливают 1% пептонной водой (не менее 5 мл в каждую пробирку), в том числе и в контрольную. Пробирки помещают в термостат при 60 ºС и выдерживают не менее 5 сут. В автоклавированных пробирках среда должна оставаться прозрачной, в контроле - мутной. Химический контроль проводят с помощью веществ, имеющих строго определенную точку плавления: бензамид или сукцинимид (126±2 оС), мочевина (132±2 оС). К последним добавляют анилиновые краски: фуксин, сафранин и др., которые при плавлении индикатора окрашивают его в тот или иной цвет.

Дезинфекция

При работе за лабораторным столом пипетки, отработанные предметные и покровные стекла погружают в сосуд с 4% раствором активированного хлорамина или 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства не менее чем на 60 мин., после чего дезинфицирующий раствор сливают в канализацию, а пипетки кипятят в мыльном растворе или 2% растворе пищевой соды.

Приготовленные мазки из споровой культуры фиксируют 30 мин 96 о спиртом, содержащим 3% Н 2О2. После отмывания мазков вода подлежит обеззара-

322

живанию автоклавированием или добавлением хлорамина до 4% концентрации с последующим его активированием. Высушивание мазков у вентилятора не допускается.

Лабораторные столы после работы протирают двукратно с интервалом 30 мин 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства. Бумагу, вату, картонные коробки и другие материалы, подлежащие уничтожению, сжигают в кремационной печи или автоклавируют, металлические предметы обжигают.

Трупы лабораторных животных сжигают в кремационной печи или автоклавируют.

Металлические ящики, садки, банки из-под животных с подстилочным материалом и экскрементами, сетчатые крышки автоклавируют или заливают на 48 ч 4% активированным раствором хлорамина либо 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства.

Противочумные костюмы (халаты, косынки, ватномарлевые маски) автоклавируют или замачивают в 1% активированном растворе хлорамина на 2 часа либо в 3% растворе перекиси водорода при температуре 50°С на 1 ч. Перчатки замачивают в 6% рас - творе перекиси водорода на 1 ч либо кипятят в 2% растворе соды 60 мин. Сапоги протирают 6% раствором перекиси водорода двукратно с интервалом в 15 мин. Помещение обрабатывают УФ при текущей дезинфекции и парами формалина при заключительной.

После проведения текущей и заключительной дезинфекции споры возбудителя сибирской язвы должны отсутствовать.

Не ранее, чем через час, но не позднее двух часов

323

после обработки, производят контроль эффективности дезинфекции. Для этого с поверхности 100 см2 5-10 объектов, подвергшихся обработке (лабораторные столы, стены, оконные рамы, двери), делают смывы ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9% раствором. Тампоны помещают в стерильные пробирки с 4-5 мл МПБ. Посевы инкубируют в тер - мостате при 37°С 18-24 ч. Из пробирок, в которых обнаружено помутнение бульона, производят высев на МПА и посевы выдерживают 18-20 ч при 37°С.

Удовлетворительная оценка качества дезинфекции дается при отсутствии роста во всех исследованных смывах.

Методики изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы

Тест «жемчужного ожерелья» на плотных питательных средах с пенициллином

Перед постановкой пробы 2% питательный агар разливают по 10 мл в 3 пробирки. В первую после расплавления и охлаждения добавляют пенициллин из расчета 0,5 ЕД/мл, во вторую - 0,05 ЕД/мл, третья пробирка - контрольная (без антибиотика). Содержимое каждой пробирки выливают в заготовленные чашки. Дно каждой чашки после застывания среды расчерчивают на квадраты или кружки, на которых подписывают номер анализа. На площадь квадрата или кружка наносят одну каплю 3-часовой бульонной культуры исследуемого штамма. На одной чашке может быть поставлено до 10 проб. Чашки инкубируют при 37 ºС, через 3 ч просматривают рост под микроскопом, предварительно накрыв каждый квадрат или кружок покровным стеклом. На среде,

324

содержащей пенициллин, наблюдаются сферопласты B. аnthracis, отдельные шары - «жемчужины», расположенные в виде цепочек. Другие аэробы имеют обычную форму клеток. В контрольной чашке B. anthracis и B. cereus образуют длинные цепи клеток. Модификация теста «жемчужного ожерелья» по Груз

К бульону Хоттингера pH 7,2 добавляют стерильно 20% инактивированной лошадиной сыворотки и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Соблюдая стерильность, среду разливают в пробирки по 2-3 мл и засевают 2 каплями бульонной или петлей агаровой культуры. Пробирки с посевами инкубируют в течение 3 ч при 37 оС. Затем делают мазки, которые фиксируют, окрашивают метиленовым синим 20 сек и микроскопи - руют. Для B. anthracis характерны шарообразные клетки в виде цепочек, напоминающих ожерелье из жемчуга. B. cereus и другие сапрофиты бацилл на среде с пенициллином растут, не меняя морфологии. Контролем служат мазки, приготовленные из бульона без пенициллина.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ДИАГНОЗ ЧУМЫ 10.1. Биологические свойства возбудителя чумы

Возбудитель чумы относится к семейству Enterobacteriaceae , роду Yersinia, виду pestis. В качестве внутривидовой классификации самой признанной за рубежом считается классификация Р. Девинья, которая, учитывая принципы формирования разновидностей в исторические эпохи и некоторые биохимические свойства штаммов, делит вид на 3 биовара: antiqua (древний), mediаevalis (средневековый) и orientalis (восточный) (табл.21).

325

Таблица 21 Внутривидовая классификацияYersinia pestis (R. Devignat)

		Отличительные признаки
	Номенклатура и краткая характери-	Фермента-	Нитрифи-	Денитрифи-
	стика разновидностей поR. Devignat	ция глице-
		рина	кация	кация
	Y. pestisvar. orientalis (восточная раз-	−	±	+
	новидность, причина пандемии 1894 г.)
	Y. pestisvar. antiqua (древняя разно-	+	±	+
	видность, причина пандемии «юсти-
	нианова чума»)
	Y. pestisvar.mediaevalis (средневековая
	разновидность, причина пандемии	+	−	−
	«черная смерть»)

В нашей стране принята единая систематическая схема подвидовых категорий, наименование которых отражает конкретные географические территории. В основу схемы положены результаты изучения штаммов, выделенных на данных территориях, методами геносистематики и нумерической таксономии. Она учитывает степень фенотипического сходства, а так же различия по содержанию ГЦ-пар в ДНК и др. Согласно этой схеме вид Y. pestis делится на 5 подвидов:

Y.pestisssp. pestis (основной), Y. pestisssp. caucasica (кавказский), Y. Pestis ssp.altaica (алтайский), Y. Pestis ssp. hissarica (гиссарский) и Y. Pestis ssp. ulegeica (улэ-

гейский) (табл.22).

Таблица 22 Таксономические признаки, характеризующие раз-

личные подвиды Y. Pestis

326