6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Организация_и_проведение_учебного_процесса_по_подготовке_специалистов

(94±0,1)°С в течение 40 сек, отжиг праймеров при тем­ пературе (60±0,1)°С в течение 40 сек, синтез комплементарной цепи при температуре (72±0,1)°С в течение 40 сек. После последнего цикла пробы прогревают в течение 3 мин при температуре (72±0,1)°С. При необходимости оставить пробы после реакции на ночь, их пом­ ещают в холодильник при температуре (4±0,1)°С или вводят дополнительный цикл на амплификаторе

(4±0,1)°С 12 ч и более.

После первого этапа амплификации для повышения чувствительности и специфичнос­ ти реакции проводят вторую стадию. Для этого готовят реакционную смесь из расчета на одну пробу: Н20 - 15,8 мкл, 10хБ - 2,5 мкл, дНТФ - 2,5 мкл, MgCl2, праймеров Вгu3 и Bru4 -по 1 мкл каждого и фермента Taq-полимеразы - 0,2 мкл. При постановке второго этапа ПЦР реакционную смесь разливают по 24 мкл в каждую пробирку, наслаивают на нее по капле ваз­елинового масла и вносят под масло по 1 мкл амплификата, полученного после первого этапа реакции.

Термоциклирование проводят по следующей схеме: 25 циклов включающих в себя ден­ атурацию при 94°С

-30 сек, отжиг праймеров при 60°С - 30 сек и синтез при 72°С - 30 сек. Заключительный цикл 72°С - 3 минуты.

Кпродуктам амплификации (после второго этапа), находящимся в микропробирках после термоциклирования, с помощью микропипетки добавляют по 4 мкл буферного раствора для нанесения проб, перемешивают пипетированием и по 15 мкл переносят в лунки геля. Затем закрывают крышку аппарата, подсоединяют блок питания, включают его и проводят электрофорез­ . Электрофорез проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора в теч­ ение 30

-40 мин. при градиенте напряжения 10 В/см до про-

417

хождения лидирующего красителя 2/3 длины трека.

Оценка результатов:

По окончании электрофореза агарозный гель извлекают из камеры и помещают на 10 мин в ванночку с раствором бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/ мл для окрашивания ПЦР-продуктов. Результат проведения ПЦР регистрируют и документируют в проходящем ультраф­ иолете с использованием документирующей видеосистемы или зеркального фотоаппарата с пленкой типа “Микрат” 300. Результаты оценивают по наличию фрагментов ДНК, полосы которых располагаются на том же уровне в геле, что и полосы в положительном контроле с препаратом ДНК. Фрагм­ ент ДНК Brucella spp. после второго этапа ПЦР имеет размер 175 н.п.

Отрицательный контроль: полоса на уровне положительного контроля должна отсутствовать­ ; наличие полосы свидетельствует о контаминации компонентов тест-системы.

Наличие полос, располагающихся выше или ниже контрольной, является неспециф­ ичным ответом и во внимание не принимается.

418

Список использованной литературы:

1.АдамовА.К.,НаумшинаМ.С.Холерныевибрионы/Сара- тов:изд-воун-та,1984.–328с.

2.Антракс (вопросы иммунологии, клиники и лаборатор­ ной диагностики) / под ред. Э.Н. Шляхова. – Кишинев: Изд-во«КартяМолдовеняскэ»,1964.–164с.

3.Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы (руководство)//Иркутск,Изд-воиркут.ун-та,1989.-92с.

4.Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии//Подред.А.А.Воробьева,А.С.Быкова-М.: МИА,2003.–233с.

5.Балахонов С.В. Использование полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике инфекционных заболев­аний // Журн. инфекционной патол. – Т. 3, № 2. – Иркутск,1996.–С.8–11.

6.Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности): Санитарно-эпидемиологические правила:СП1.3.1285-03//Бюллетеньнормативныхимето- дических документов Госсанэпиднадзора - Москва, 2003, -Вып.3(13).–С.67-132.

7.Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08идополнениякнимСП1.3.2518-09.–М.,2009.

8.БелозеровЕ.С.Бруцеллез.Медицина,1985г.—183с.

9.Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л.Б. Борисов. – М.: Медицинское инфор- мационноеагентство,2002.–734с.

10.Бруцеллез / Под ред. П. А. Вершиловой — М., 1972 г.— 439с.

11.Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. – М.:Медицина,1984.–212с.

12.Галактионов В.Г. Иммунология: Учебник. – М.: «РИЦ МДК»,2005.

419

13.ГОСТ 12.4, 064-84 «Костюмы изолирующие. Общие техническиетребованияиметодыиспытания».

14.Дроздов С.Г., Гарин Н.С., Джиндоян Л.С., Тарасенко В.М. Основы техники безопасности в микробиологических и вирусологическихлабораториях.–М.:Изд-воМедицина, 1987.–256с.

15.Забор, транспортировка, хранение клинического мате­ риала для ПЦР-диагностики: метод. рекомендации. – М.:

ОООИнтерлабсервис,2005.–16с.

16.Иммунология. Методы исследования // Под ред. И. Лефко- витса,Б.Перниса.-Москва,Мир,1983.–339с.

17.ИвановаС.М.Возбудительсибирскойязвы//Возбудители зоонозныхинфекций.Частнаямедицинскаямикробиоло­ гия с техникой микробиологических исследований / под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. – М.:

Медицина,2005.–С.211–223.

18.Иммунология в 3-х томах // под ред. У. Пола. – Москва Мир,1987.

19.Инструкция и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей. – М.: Минздрав СССР, Главное управлениекар­антинныхинфекций,1980.–63с.

20.Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях. Руководство.–М.:Федеральныйцентргоссанэпиднадзора МинздраваРоссии,2005.–46с.

21.Кирдей Е.Г. Иммунология. Иркутск, 2000. – Изд. ИГМУ.

–231с.

22.КеттиД.Антитела.Методы.–М.:Мир,1991.-300с.

23.Коллинз Ц.П. Новые методы иммуноанализа. – М.: Мир, 1991.–485с.

24.Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза:

420

Методические указания: МУ 3.3.2.2124-06. - М., 2007. - 35

с.

25.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. – Санкт-Петербург: Специальнаялитература,2002.-591с.

26.Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство под ред. академика РАМН, профессора Г.Г. Онищенко, чл.-корр. РАМН, про- фессораВ.В.Кутырева//М.:Медицина,2009.-472с.

27.Лабораторнаядиагностикахолеры:МУК4.2.2218-07.

28.Лимфоциты. Методы // Под ред. Дж. Клауса. – Москва,

Мир,1990.-395с.

29.Медицинская микробиология / Главные редакторы В.И. Покровский, О.К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998.–1183с.

30.Медицинская микробиология / Под ред. А.М. Королюка, В.Б.Сбойчакова.–СПб.,1999.–267с.

31.Медицинская микробиология, иммунология и вирусоло- гия/Подред.А.И.Коротяева.–СПб.:«Специальнаялите-

ратура».–1998.–580с.

32.Методические рекомендации по детекции детерминант вирулентности холерного вибриона с использованием мультиплексной ПЦР /Балахонов С.В., Миронова Л.В., ПогореловВ.И.,УрбановичЛ.Я.–Иркутск,2002.–11с.

33.МетодическиеуказанияМУ3.1.2007-05.3.1.Профилакти- каинфекционныхболезней.Эпидемиологическийнадзор затуляремией.–М.,2005.–34с.

34.Методические указания по профилактике и лаборатор- нойдиагностикебруцеллезалюдей.Москва,1980г.-54с.

35.Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями / М.:

МЗСССР,1984.–36с.

36.Методические указания по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в по-

421

мещениях МУ 11-16 / 03-06 от 28.02.95. – М.: Минздрав-

МедпромРоссии,1995.

37.Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157:H7: Методические указания. МУК 4.2.992-00 / Минздрав России – М., 2001.

–29с.

38.Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов / Под ред. В.Н. Милютина. – Ростов-на-Дону, 1981. – 175с.

39.Микробиологическая диагностика сибирской язвы / Л.И. Маринин[идр.].–М.:ВУНМЦМЗРФ,1999.–222с.

40.Никитин В.М. Справочник методов иммунологии // Ки-

шенев,«Штиинца»,1982.-303с.

41.Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методомПЦР:Методическиеуказания.МУ3.5.5.1034-01/ М.:МинздравРоссии,2001.

42.Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лаборатор- наядиагностикавозбудителятуляремии.М.,1975.–194с.

43.Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания МУК4.2.1890-04.–М.,2004.–92с.

44.Определитель бактерий Берджи / Девятое издание. I том. Перевод с английского под ред. Г.А. Заварзина. – М.: «Мир».–1997.–180-294с.

45.Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности: МУ 1.3.1794-03. – Федеральный центрГСЭНМинздраваРоссии.–М.,2003.

46.Организацияипроведениеэпидемиологическогонадзора вприродныхочагахчумынатерриторииРоссийскойФедерации: Методические указания: МУ 3.1.1098-02. – М., 2009.–103с.

47.Особенности методических приемов при работе с возбу-

422

дителями инфекционных болезней человека I и II группы патогенности бактериальной этиологии: Руководство / Сост. В.С. Уралева, М.М. Гулида, С.А. Лебедева и др. –

Ростов-н/Д,1989.–208с.

48.Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебнопрофилактических учреждений : СанПиН 2.1.7.728-99. – М.:МинздравРоссии.–1999.

49.Поздеев О.К. Медицинская микробиология под ред. В.И.Покровского //- 4-е изд., испр. – М., ГЭОТАР-Медиа, 2008.-768с.

50.Поздеев О.К. Энтеробактерии: руководство для врачей //

М.,ГЭОТАР-Медиа,2007.-720с.

51.Порядок организации и проведения лабораторной диагностики холеры для лабораторий территориального, ре- гиональногоифедеральногоуровней:МУК4.2.2870-11.

52.Порядок выдачи санитарно - эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифици- рованными микроорганизмами, ядами биологического происхожденияигельминтами:Санитарныеправила.СП

1.2.1318-03.–М.:МинздравРоссии,2003.

53.Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмовI-IVгрупппатогенности:СП1.2.036-95.

54.Практикумпоиммунологии/Подред.И.АКондратьеваи А.А.Ярилин.Москва:ECADEMA,2004.–272с.

55.Практикум по микробиологии // Под ред. Нетрусова. –

Москва,2005.–603с.

56.Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей: Методические указания: МУ 3.1.7.1189-03. – М., 2003.-47с.

57.Профилактикахолеры.Общиетребованиякэпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации:СП3.1.1.2521-09.

423

58.Профилактика холеры. Организационные мероприятия. Оценкапротивоэпидемическойготовностимедицинских учреждений к проведению мероприятий на случай воз- никновенияочагахолеры:МУ3.1.1.2232-07.

59.Руководство по медицинской микробиологии. В 2-х томах под ред. А.С. Лабинской, Е.Г. Володиной // М., Изд-во БИНОМ, 2008. (2010).

60.Руководство по профилактике чумы под ред. проф. А.В. Наумова, проф. Л.В. Самойловой. – Саратов, 1992. – 278 с.

61.Сибирская язва / Н.П. Буравцева [и др.] // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. – Саратов, 1998. – Т. 7. – С. 50–89.

62.Тучков И.В. Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возб­ удителя сибирской язвы // Автореф. дис. … канд. мед. наук : 03.00.07, 03.00.15 / Рос. противочум. ин-т «Микроб». – Саратов, 2005. – 19 с.

63.Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. – М., Медицина, 2005. – 600 с.

64.Чернышева М. И. и др. Использование кислого антигена роз-бенгал в пласт­инчатой реакции агглютинации при бруцеллезе у людей // Журнал микробиоло­ гии,эпидемиологииииммунобиологии—1980—№ 6 — С. 84—88.

65.Энтеробактерии / Руководство для врачей под ред. В.И. Покровского. – М.: «Медицина», 1985. – 319 с.

66.Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин В.С. Иммуноферментный анализ в микробиологии. – Изд. Саратовского университета. – 1990. – 92 с.

424