Сборник статей 2014

ДИЗАЙН ЭКСПРЕССИОННОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИМИКРОБНОГО ПЕПТИДА UBI18-35 В БАКТЕРИАЛЬНОЙ СИСТЕМЕ.

Д.О. Бурлакова

Сибирский государственный медицинский университет г. Томск, ЦНИЛ

Актуальность. Антимикробные пептиды (АМП) представляют собой короткие молекулы, длиной 15-50 аминокислотных остатков, преимущественно гидрофобные, что позволяет им селективно взаимодействовать с мембраной микроорганизма, нейтрализуя устойчивость бактерии к антибиотику. Использование АМП открывает широкие перспективы в области терапии в качестве антибиотических препаратов нового поколения, а также клинической иммунологии, лабораторной диагностике и научных исследований. Так, с использованием радиоактивно-меченного АМП убиквицидина (UBI18-35), предложен подход к высокоэффектвиной дифференциальной диагностике патологических процессов, обусловленных микробной инфекцией (M.M. Welling, 2001). В настоящее время АМП получают методом твердофазного синтеза, который является высокозатратным. В связи с этим крайне актуальным становится развитие подходов к получению рекомбинантных АМП, что обусловлено высокой экономической эффективностью микробиологических методов синтеза для широкомасштабного производства белковых препаратов (Y.Li., 2011).. Однако производство АМП в бактериальной системе сопряжено с некоторыми трудностями. Во-первых, проявляется губительный эффект антимикробного пептида по отношению к клетке-хозяину, а вовторых, из-за малых размеров молекулы и катионного характера пептида, он высоко подвержен протеолитической деградации. Решение данных проблем может быть достигнуто за счет получения АПМ в интеграции с белком-партнером и оптимизации условий экспрессии.

Цель. Выполнить дизайн конструкции для получения АМП UBI18-35 в бактериальной системе.

Материалы и методы. В работе использовалась плазмида pET31b (Novagen), штаммы E.coli XL-blue, Rosetta DE3 LysS. Приготовление компетентных клеток и трансформацию проводили стандартными методами (Маниатис, 1988). Синтетические олигонуклеотиды были синтезированы ЗАО «Биосинтез» (Новосибирск). Выделение плазмиды и очистку ДНК-фрагментов проводили на колонке с использованием наборов Plasmid Miniprep и Сlenup standard (Evrogen). Синтез фрагмента кодирующей последовательности проводили методом ПЦР (Applied Biosystems). Рестрикцию проводили c использованием ферментов Vne I, PstN I (SibEnzyme) согласно инструкции фирмы-производителя. Дефосфорилирование плазмиды осуществляли с использованием термолабильной щелочной фосфатазы (SibEnzyme). Электрофоретический анализ проводили в 1,2% агарозном геле. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически (Nanodrop 2000 с).

Результаты. В качестве вектора нами была выбрана плазмида pET31b(). Данная плазмида позволяет экспрессировать пептид в составе белка-слияния с кетостероидизомеразой. В результате химерный белок формирует тельца включения, что с одной стороны защищает пептид от протеолиза, а с другой обеспечивает легкость последующей его очистки. В результате трансформации клеток E. coli XL Blue плазмидой, наблюдали рост бактериальных колоний на селективной среде c добавлением ампициллина (25 мкг/мл). Дополнительная идентификация плазмиды была выполнена методом рестрикционного анализа. При электрофоретическом разделение фрагментов полученных в результате гидролиза плазмиды, выделенной из ампициллин-устойчивых клеток, рестриктазой Vne I, в агарозном геле выявляли ожидаемый набор четырех фрагментов с длинами 1349 п.о., 3284 п.о., 3784 п.о., 5024 п.о.

Пептид UBI18-35 представлен следующей аминокислотной последовательностью: KVAKQEKKKKKTGRAKRR. С учетом частоты встречаемости кодонов аминокислотная

309

последовательность была переведена в нуклеотидную: 5’- aaagtggcgaaacaggaaaagaaaaagaaaaagaccggtcgtgcgaaacgtcgt-3’. На 5’-конец последовательности добавлен стартовый кодон ATG, и далее она фланкирована последовательностями CAGATGCTG – сайт узнавания PstN I. Дополнительно на 5’- и 3’- концы добавляли по 4 н.о., обеспечивающих успешность посадки эндонуклеазы рестрикции. Соответственно для получения фрагмента были синтезированы два олигонуклеотида длиной 56 н.о и зоной перекрывания 26 н.о:

5’-tcaccagatgctgatgaaagtggcgaaacaggaaaagaaaaagaaaaagaccggtc-3’ 5’-gacacagcatctgcatacgacgtttcgcacgaccggtctttttctttttcttttcc-3’

Фрагмент двухцепочечной ДНК кодирующей UBI18-35 был получен методом ПЦР (начальная денатурация 95°С – 5 минут, 20 циклов: 95°С – 15 сек., отжиг 57°С – 3 минуты, элонгация 72°С – 30 сек, финальная элонгация 1 минута).

Плазмиду и фрагмент обрабатывали ферментом PstN I, плазмиду дополнительно обрабатывали щелочной фосфатазой. Реакционные смеси разделяли в агарозном геле и выделяли кодирующий пептид фрагмент и линеаризованную, дефосфорилированую плазмиду из геля. Спектрофотомтерический анализ показал, что концентрации плазмиды и вставки после очистки составили 19,7 нг/мкл и 31,4 нг/мкл, соответственно.

Выводы. Нами выполнен дизайн векторной конструкции, синтезирован фрагмент двухцепочечной ДНК и подготовлен линеаризованный вектор для проведения лигирования и трансформации бактериальных клеток с целью получения анитимикробного пептида UBI18-35 в бактериальной системе.

СОДЕРЖАНИЕ γΔТ-ЛИМФОЦИТОВ В КРОВИ У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ

Е.В. Михалицкая

Сибирский государственный медицинский университет г. Томск Кафедра патофизиологии

Актуальность. В иммунопатогенезе туберкулеза легких тесно взаимосвязаны механизмы врожденного и адаптивного иммунитета, посредниками взаимодействия между которыми, наряду с дендритными клетками и макрофагами, считаются γδТ-клетки. γδТклетки – минорная МНС-нерестриктированная популяция Т-лимфоцитов, являющаяся разновидностью естественных регуляторных Т-клеток. Для распознавания антигена γδТлимфоцитам не нужны молекулы главного комплекса гистосовместимости, они могут непосредственно связываться с фосфолипидами Mycobacterium tuberculosis. Таким образом, γδТ-клетки являются “первой линией защиты” против микобактериальных антигенов, выполняя эффекторные и регуляторные функции в процессе реализации иммунного ответа на M. Tuberculosis. Предполагается, что γδТ-клетки могут быть использованы для создания противотуберкулезной вакцины нового поколения, а также для усовершенствования методов клеточной иммунотерапии.

Цель. Оценить содержание γδТ-клеток в крови у больных туберкулезом легких в зависимости от клинической формы и варианта течения заболевания.

Материалы и методы. В ходе работы обследовано 40 больных с распространенным деструктивным впервые выявленным туберкулезом легких (ТБ) (30 мужчин и 10 женщин в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст – 47±11 лет). Контрольную группу составили 15 мужчин и женщин аналогичного возраста. Материалом исследования являлась периферическая венозная кровь. Выделение лимфоцитов из цельной крови проводилось методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3). Для определения количества γδTCR-позитивных лимфоцитов в периферической крови применяли метод лазерной проточной цитометрии (цитометр FACSCalibur (Becton Dickinson, США)) с использованием моноклональных антител к лимфоцитарным

310

рецепторам Anti-TCR-g/d-1, меченых РЕ (кат. № 333141) («Becton Dickinson», США). Статистический анализ результатов исследования проводили с использованием стандартного пакета программ SPSS v.11.0.

Результаты. В результате проведенного исследования у пациентов с инфильтративным и диссеминированным ТБ установлено статистически значимое снижение содержания γδТ-клеток в крови по сравнению с группой контроля в 1,6 (р=0,029) и 2,3 (р=0,014) раза соответственно. Также выявлено снижение количества γδТ-клеток в периферической крови у пациентов с лекарственно-чувствительным диссеминированным ТБ в 2,5 раза (р=0,036) и у пациентов с лекарственно-устойчивым инфильтративным ТБ в 1,6 раза (р=0,046) по сравнению с группой здоровых добровольцев.

Выводы. 1) Инфильтративный ТБ в сочетании с лекарственной устойчивостью возбудителя и диссеминированный ТБ в сочетании с лекарственной чувствительностью возбудителя ассоциированы со значительным снижением численности γδТ-лимфоцитов в периферической крови.

2) Дефицит циркулирующих γδТ-лимфоцитов в крови у больных ТБ может быть обусловлен пополнением пула резидентных γδТ-клеток в ткани респираторного тракта для поддержания локального иммунного ответа, репарации и интегративности альвеолярного эпителия, равно как и гибелью циркулирующих γδТ-клеток за счет активации антигениндуцированного рецепторного апоптоза.

ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ РИНОЦИТОГРАММЫ И ИНТЕРЛЕЙКИНА-18 ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЛОКАЛЬНОЙ ИММУНОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ АДЕНОИДИТОМ, ОСЛОЖНЁННЫМ ЭКССУДАТИВНЫМ СРЕДНИМ ОТИТОМ

А.В. Ситникова, Н.А. Аргунова, Б.Б. Акжолова

Сибирский государственный медицинский университет г. Томск Кафедра иммунологии и аллергологии

Актуальность. Хронические аденоидиты (ХА) составляют 20-56% заболеваний верхних дыхательных путей у детей. Одним из часто встречаемых и достаточно сёрьёзных осложнений ХА является экссудативный средний отит (ЭСО). Если ребенка с ЭСО не лечить, то может развиться необратимая тугоухость, что влечёт за собой снижение качества жизни ребенка.

Наиболее частой причиной хронизации воспалительного процесса в полости носоглотки, являются нарушения в системе мукозального иммунитета. Макрофаги, принимают участие в поддержании местного иммунитета. Активированные макрофаги продуцируют биологически активные вещества, которые оказывают регулирующее влияние на многие клетки и системы организма, а также обладают фагоцитарной способностью и бактерицидностью.

Цель. Проследить динамику параметров, характеризующих функциональную активность макрофагов на слизистой носовой полости, у детей с ХА, осложнённым ЭСО, при использовании в комплексной терапии локального иммуномодулирующего препарата.

Материалы и методы. Было обследовано 38 детей с диагнозом «хронический аденоидит», осложненный ЭСО. Обследование проводилось до начала лечения и через 1 и 3 месяца после лечения. В качестве материалов для исследования использовали мазкиотпечатки со слизистой носовой полости и назальный смыв. Первую клиническую группу составили пациенты, получавшие базисную противовоспалительную терапию (n=21). Вторую клиническую группу составили пациенты, получавшие базисную терапию в комплексе с иммуномодулирующим препаратом (n=17). В качестве контрольной группы были обследованы 16 относительно здоровых детей, без хронических воспалительных заболеваний на слизистой дыхательных путей. Методом иммуноферментного анализа в

311

назальном смыве определяли концентрацию интерлейкина (ИЛ)-18 («ИЛ-18 – ИФАБест», «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Подсчёт относительного количества макрофагов на мазках-отпечатках проводили на световом микроскопе «Микмед-5». Для статистической обработки использовали пакет программ «SPSS Statistica», версия 17.0.

Результаты. Анализ полученных данных не выявил статистически значимых различий концентрации ИЛ-18 между группой здоровых и детей, получавших базисную противовоспалительную терапию, на протяжении всего срока наблюдения. Также не было получено значимых различий по содержанию ИЛ-18 между группой здоровых и детей, получавших лечение с использованием иммунотропного препарата. В результате сравнительного анализа динамики изменений концентрации ИЛ-18 в назальном смыве (1 и 3 месяца после лечения) мы не получили статистически значимых различий между группами детей, получавших только базисное лечение, и детей, для лечения которых дополнительно использовали локальный иммуномодулятор.

При оценке результатов цитологического исследования не обнаружено достоверных различий в содержании макрофагов между группами здоровых и детей, получавших базисное лечение, на протяжении всего периода наблюдения. Также не было выявлено статистически значимых различий с показателями контрольной группы при сравнении относительного содержания макрофагов в составе риноцитограммы у детей, получавших лечение с использованием иммунотропного препарата. Анализ динамики относительного количества макрофагов показал, что через 1 и 3 месяца после лечения этот показатель значимо снижается в сравнении с его исходными значениями (до лечения), как в группе детей, получавших только базисную терапию, так и в группе детей, пролеченных с использованием иммуномодулятора.

Выводы. Динамика изменений относительного содержания макрофагов в составе риноцитограммы через 1 и 3 месяца после лечения пациентов с ХА, осложненным ЭСО, носит однонаправленный характер и проявляется снижением численности клеток макрофагального звена на фоне относительно стабильного уровня ИЛ-18 как после курса базисной терапии, так и при использовании в комплексном лечении локального иммуномодулятора.

ВЛИЯНИЕ ЛОКАЛЬНОЙ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ У ПАЦИЕНТОВ С ЭКССУДАТИВНЫМ СРЕДНИМ ОТИТОМ НА ФОНЕ ВОСПАЛЕНИЯ ГЛОТОЧНЫХ МИНДАЛИН

Н.А. Аргунова, А.В. Ситникова, Б.Б. Акжолова

Сибирский государственный медицинский университет г. Томск Кафедра иммунологии и аллергологии

Актуальность. Хронический аденоидит и гипертрофия глоточной миндалины являются наиболее частыми заболеваниями в детской оториноларингологии. Прогрессирующая гипертрофия может приводить к осложнениям, затрагивающим органы слуха, одним из которых является экссудативный средний отит (ЭСО). Данное заболевание может приводить к необратимым последствиям, характеризующимся стойкой потерей слуха. Часто причиной хронизации процесса воспаления является снижение активности местного иммунитета. Большое значение в поддержании функциональной активности местного иммунитета играют нейтрофилы.

Цель. Оценить влияние локальной иммуномодулирующей терапии на функциональную активность нейтрофилов у пациентов с экссудативным средним отитом на фоне воспаления глоточных миндалин.

Материалы и методы. Обследованы 38 детей с диагнозом «хронический аденоидит», осложненный ЭСО. В первую группу вошли пациенты, получавшие базисную

312

противовоспалительную терапию (21 человек). Во вторую группу вошли пациенты, получавшие базисную терапию в комплексе с иммуномодулирующим препаратом (17 человек). Обследование проводилось до начала лечения, а также через 1 и 3 месяца после лечения. Контрольную группу составили относительно здоровые дети, без хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей. Материалами для исследования являлись мазки-отпечатки со слизистой носа и назальный смыв. В мазках-отпечатках оценивали клеточный состав и определяли относительное количество нейтрофилов. Исследование проводили на световом микроскопе «Микмед-5». В назальных смывах определяли концентрацию хемокина для нейтрофилов – интерлейкина (IL)-8 методом иммуноферментного анализа («ИЛ-8 – ИФА-Бест», «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Для статистической обработки использовали пакет программ «SPSS Statistica», версия 17.0

Результаты. В группе пациентов, получавших базисную терапию, концентрации IL-8 была достоверно снижена в сравнении с группой здоровых в течение всего периода наблюдения ( р=0,001). Анализ мазков-отпечатков со слизистой носа не показал значимых различий количества нейтрофилов между группой здоровых и группой пациентов, получавших базисную противовоспалительную терапию. В группе пациентов, получавших базисную терапию в комплексе с иммуномодулирующим препаратом, концентрация IL-8 также была достоверно снижена по сравнению со здоровыми в течение всего периода наблюдения, как до начала терапии и через месяц после терапии (р=0,001), так и через 3 месяца после лечения (р=0,002). Количество нейтрофилов повысилось по сравнению со здоровыми через 1 месяц после терапии (р=0,001) и оставалось высоким через 3 месяца после лечения (р= 0,046).Анализируя динамику исследованных параметров

вкаждой клинической группе по отношению к исходному уровню (до лечения), мы выявили, что концентрация IL-8 у пациентов, получавших базисную терапию, повысилась через 1 месяц после лечения по сравнению с исходной (р=0,01) и снизилась через 3 месяца

всравнении с первоначальными значениями (р=0,004). Значимых изменений в динамике количества нейтрофилов не наблюдалось. У пациентов, получавших базисную терапию в комплексе с иммуномодулирующим препаратом, не наблюдалось в динамике наблюдения статистически значимых изменений концентрации IL-8 по сравнению с исходным уровнем, тогда как количество нейтрофилов значимо возросло через 3 месяца после лечения по сравнению с результатами, полученными через месяц терапии (р=0,04).Сравнительный анализ динамики показателей в разных клинических группах не выявил статистически значимых различий.

Выводы. Применение локального иммуномодулятора в комплексной терапии хронического аденоидита, ассоциированного с экссудативным средним отитом, не влияет на концентрацию IL-8 в назальном смыве, но усиливает миграцию нейтрофилов на слизистую носовой полости, что, вероятно, обусловлено другими хемотаксическими факторами.

ИЗМЕНЕНИЕ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА У ПАЦИЕНТОВ С ЦИРРОЗОМ ПЕЧЕНИ В ИСХОДЕ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С

А.С. Емельянов

ЧГМА г. Чита Кафедра инфекционных болезней и эпидемиологии

Актуальность. В организме человека два основных детоксирующие системы — печень, осуществляющая защиту организма посредством окислительных реакций, и микрофлора пищеварительного тракта, использующая для этих целей гидролитические восстановительные процессы. Нарушение их взаимодействия приводит к взаимным функциональным и структурным изменениям в них самих и в организме в целом. Большинство авторов указывают, что при заболеваниях печени кишечный микробиоценоз

313

нарушен более чем в 50% случаев, однако при этом частота выявляемости отдельных степеней дисбиоза при циррозах печени в исходе хронического вирусного гепатита С (ХВГС) изучена недостаточно.

Цель. Выявить взаимосвязь между степенью активности, стадией фибротических изменений при циррозе печени в исходе хронического вирусного гепатита С и структурными изменениями микрофлоры кишечника.

Материалы и методы. Под наблюдением находилось 40 больных с циррозами печени в исходе ХВГС в возрасте от 35 до 60 лет. Диагноз установлен на основании наличия признаков диффузного поражения печени, синдрома печёночно-клеточной недостаточности и портальной гипертензии, а также данных серологического и молекулярно-генетического (ПЦР) методов с учетом классификации цирроза по ЧайлдПью. Контрольная группа – 20 практически здоровых пациента, сопоставимых с больными циррозами по возрасту, полу, не имевших в анамнезе заболеваний печени. Исследование кишечной микробиоты проводилось с помощью бактериологического метода с использованием стандартных питательных сред и биохимического метода (Стрип

– тест) для выявления резидентной, условно – патогенной и транзиторной микрофлоры. Результаты. У пациентов с циррозом печени вирусной этиологии отмечается

снижение содержания Bifidum spp – 8,9*107/г, Bacteroides spp 3,5 *107/г, что говорит о сниженном пассаже желчи в просвет кишечника, нарушении энтерогепатической циркуляции желчных кислот, снижении эмульгирования, всасывания липидов нарушении пристеночного пищеварения; снижение содержания Enterococcus spp – 3,7 * 107/г, количество типичной E.coli – 8,8 *107 /г., при этом – усиление роста E.coli с низкими ферментативными свойствами – 1,4 *108 /г, а также – лактозонегатиных E.coli – 1,9 *106 /г. Выявлена прямопропорциональная зависимость между степенью биохимической активности и выраженностью нарушений кишечной микробиоты. Максимальный рост Candida spp в этой группе отмечался у пациентов с выраженным синдромом портальной гипертензии, что спасобствует развитию бродильной диспепсии. А также выявлен пограничный уровень Staphylococcus saprophyticus – 1,4*104 /г, снижение Streptococcus lactis -6,3*107 /г; При этом количество Lactobacillus spp - в пределах нормы – 7,2*107 /г. Стоит отметить, что у пациентов отсутствовали Staphylococcus aureus и гемолизирующие микроорганизмы.

Выводы. 1) Характер микробиоциноза при циррозе печени в исходе хронического вирусного гепатита С напрямую зависит от степени активности процесса. 2) Степень дисбиоза коррелирует как со стадией фибротических изменений, так и со степенью активности процесса.

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ЗОНДЫ И КРАСИТЕЛИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Т.А. Пируева

ГБОУ ВПО КрасГМУ им. Проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава России г. Красноярск НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, Кафедра общей хирургии, Кафедра микробиологии им. Доц. Б.М. Зельмановича,

Кафедра биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии

Актуальность. Весьма актуальной проблемой на сегодняшний день является формирование на различных поверхностях биопленок – микробных конгломератов, окруженных полисахаридным матриксом и имеющих особенности развития и функционирования, способствующие неудовлетворительной терапии хирургических инфекций (Винник Ю.С. и др., 2010). Для оценки жизнеспособности прокариотических

314

клеток в составе данных сообществ многие исследователи используют метод флуоресцентной микроскопии (Wong G.C.L., 2011). Однако, до настоящего времени отсутствует единое мнение на проблему выбора флуоресцентных красителей для оценки жизнеспособности микроорганизмов в микробной биопленке.

Цель. Изучить принципы работы различных флуоресцентных зондов и красителей и выбрать наиболее оптимальные для оценки жизнеспособности бактериальных клеток для конфокальной микроскопии.

Материалы и методы. Был проведен обзор и анализ 28 литературных источников по особенностям использования, преимуществам и недостаткам использования флуоресцентных зондов для оценки жизнеспособности микроорганизмов.

Результаты. На современном уровне существует довольно большое количество различных методов окраски, позволяющих оценить жизнеспособность микробных биопленок; однако, далеко не все они способны дать информацию не только о количественном, но и физико-химическом состоянии клеток (Davies C. Et al., 1991). Среди других известных методов оценки жизнеспособности клеток (морфометрия, радиоавтография, термистометрия, окраска витальными красителями и МТТ с подсчетом в камере Горяева, гемоцитометрах или счетчиках клеток), использование флуоресцентных красителей и зондов обращает на себя внимание ввиду их неинвазивности для живых клеток, простоты использования и информативности, возможности наблюдения динамических процессов (к примеру, возможно наблюдение в течение нескольких часов или дней роста микробной биопленки в перфузионной камере при конфокальной микроскопии), быстроты проведения исследования (Dufour P. Et al., 1992; Millar D., 1996; Герасимов И.Г. и др., 2007; Драпеза А.И. и др., 2012). Распространенными являются красители нуклеиновых кислот – акридиновый оранжевый, этидиум бромид, SYTO 9, пропидиум йодид (PI), DAPI; красители, связывающиеся с белками, например, АНС, а также пирен, мишенью которого являются неполярные области между жирнокислотными цепями фосфолипидов мембран (Molecular Probes Inc., 2003). Данные красители отличаются по своей способности проникать в клетку и дифференцировать живые и погибшие микроорганизмы по интенсивности их флуоресценции. Акридиновый оранжевый, SYTO 9, АНС и пирен не способны дифференцировать грамположительные и грамотрицательные, живые и погибшие клетки, окрашивая популяцию бактерий и/или грибов в ярко-оранжевый и зеленый цвета (McFeters G.A. et al., 1991; Peyyala R. Et al., 2011;). Этидиум бромид и пропидиум йодид не способны проникать в неповрежденные клетки, окрашивая бактерии с дефектами мембраны. Существуют коммерческие наборы красителей, к примеру, LIVE/DEAD BacLight Viability Kits (Invitrogen), который включает два красителя: SYTO 9 окрашивает нуклеиновые кислоты как живых, так и погибших клеток, а PI – проникает через поврежденную мембрану мертвых клеток, подавляя при этом интенсивность флуоресценции SYTO 9. Исходя из этого, клетки, окрашенные только SYTO 9, являются жизнеспособными, а окрашенные только PI или PI и SYTO 9, являются погибшими.

Выводы. Таким образом, для оценки жизнеспособности бактериальных клеток в составе биопленок целесообразнее использовать комбинацию из нескольких флуоресцентных зондов, окрашивающих нуклеиновые кислоты и проникающих внутрь поврежденной мембраны погибших клеток (SYTO/PI или акридиновый оранжевый/этидиум бромид и др.), которые позволяют четко отличать живые клетки от мертвых, могут использоваться для широкого спектра микроорганизмов (могут окрашивать ДНК и/или РНК как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, грибов), являются простыми методами, позволяющими проводить динамические наблюдения и не повреждающими живые клетки при их оценке.

315

ВЗАИМОСВЯЗЬ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ РSEUDOMONAS АERUGINOSA К БАКТЕРИОФАГУ И ПИГМЕНТООБРАЗОВАНИЯ

В.С. Добродеева

Сибирский государственный медицинский университет г. Томск Кафедра микробиологии и вирусологии

Актуальность. Р. аeruginosa является одним из наиболее частых возбудителей внутрибольничных инфекций. Важным диагностическим признаком при синегнойной инфекции является пигментообразование. Пигменты Р. аeruginosa пиовердин и пиоцианин одновременно синтезируются подавляемым большинством штаммов и вносят определенный вклад в патогенез синегнойной инфекции, являясь факторами патогенности. Эти пигменты являются важными метаболитами в жизнедеятельности Р. аeruginosa. Так пиоцианин является мощным окислителем и обладает широким спектром антибиотической активности, что повышает ее конкурентоспособность. Пиовердин проявляет признаки антиоксиданта и, обладая хелатными свойствами, обеспечивает бактериальную клетку железом.

Бактериофаг Р. аeruginosa используют в лечении синегнойных инфекций, особенно в случаях когда антибиотикотерапия не эффективна. Однако использование бактериофага не всегда приносит желаемый результат.

Представляет интерес, способны ли пигменты Р. аeruginosa влиять на ее чувствительность к бактериофагу.

Цель. Определить влияние пигментов на чувствительность Р. аeruginosa к бактериофагу. Материалы и методы. Исследована чувствительность 66 штаммов Р. аeruginosa – клинических изолятов к коммерческому препарату «Бактериофаг псевдомонас аэругиноза (синегнойный)» на средах стимулирующих синтез пиовердина и пиоцианина. Результаты. . Из 66 исследованных штаммов Р. аeruginosa 33 штамма не проявили чувствительности к бактериофагу ни на одной из сред, а 33 – проявили, что выражалось в появлении зон лизиса в месте нанесения бактериофага. Из 33 штаммов, проявляющих чувствительность к бактериофагу, 15 штаммов имели одинаковую чувствительность на средах, стимулирующих синтез пиовердина или пиоцианина, а 18 штаммов проявили чувствительность только на одной из сред. Из этих 18 штаммов 16 были резистентны к бактериофагу на среде, стимулирующей синтез пиовердина, а 2 штамма – чувствительны к бактериофагу на этой же среде.

Выводы.В ходе проведенного исследования было установлено, что активность бактериофага зависит от наличия в питательной среде пиовердина. Пониженная чувствительность штаммов в присутствии пиовердина может быть связана как с нарушением процесса проникновения фага, так и его адсорбции. Процесс проникновения некоторых бактериофагов, например фагов T2 семейства Myoviridae, внутрь бактериальной клетки является цинкзависимым. Известно также, что пиовердин способен связывать не только ионы железа, но и других металлов (цинка, магния и др.). Принимая во внимание хелатные свойства пиовердина можно предположить, что он связывает ионы цинка, препятствуя проникновению одного из бактериофагов, содержащихся в препарате «Бактериофаг псевдомонас аэругиноза (синегнойный)» - KMV семейства Myoviridae. Также известно, что некоторые бактериофаги для адсорбции используют белки наружной мембраны, участвующие в формировании канала для транспорта железа. Возможно, что пиовердин конкурирует с бактериофагом KMV за этот рецептор.

Полученные нами результаты позволяют говорить о возможном снижении чувствительности синегнойной палочки к бактериофагу в присутствии пиовердина. Однако необходимо проведение дополнительных исследований для выяснения механизмов этого явления.

316

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СОВРЕМЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В БАКТЕРИОСКОПИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

В.О. Соболева

Красноярский государственный медицинский университет г. Красноярск Кафедра медицинской кибернетики

Актуальность. Бактериоскопия биологического материала является одним из основных методов диагностики туберкулеза в первичном звене здравоохранения. Повышение скорости и качества диагностики туберкулеза возможно путем автоматизации бактериоскопии с использованием современных технологий обработки изображений. Цель. Создание метода автоматизации поиска микобактерий туберкулеза при бактериоскопии мокроты.

Материалы и методы. Для разработки алгоритма обнаружения микобактерии туберкулеза с использованием цифровых изображений биологических объектов (мокроты), нами использовался биологических материал (мокрота) от больных с установленным заболеванием туберкулеза легких, подтвержденным рентгенологическим, бактериологическим (посев мокроты), молекулярно-генетическим (ПЦР) методами исследования.

Окрашенные по Цилю-Нильсону мазки подвергались световой микроскопии и выполнялись фотоснимки в цифровом формате.

Цифровые фотографии обрабатывались по алгоритму, позволяющему выделить особенности объектов микроскопии для идентификации микобактерии туберкулеза. Результаты. Разработан метод автоматического обнаружения микобактерии туберкулеза в мазках мокроты, окрашенных по Цилю-Нильсену, при выполнении световой микроскопии. Метод основан на комбинированном использовании фотометрических и геометрических особенностей микобактерии туберкулеза на цифровом фотоснимке.

Разработана компьютерная программа, которая позволяет выделять необходимые объекты в мазке биологического материала и идентифицировать их, как микобактерию туберкулеза. Тестирование компьютерной программы осуществлялось на фотоснимках, сделанных при исследовании мокроты больных туберкулезом легких. Результаты тестирования показали высокую чувствительность метода.

Выводы.Результаты исследования позволяют сделать предварительные выводы о том, что разработанный метод автоматического обнаружения микобактерии туберкулеза на цифровых фотоснимках мазков мокроты окрашенных по Цилю-Нильсену, при выполнении световой микроскопии позволяет классифицировать выделенные объекты, как «микобактерия туберкулеза» - «артефакт».

Использование компьютерной программы должно повысить качество и скорость микробиологической диагностики туберкулеза в общей лечебной сети.

317

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ПЕДИАТРИИ

ОСТРЫЕ РЕСПИРАТОРНЫЕ ИНФЕКЦИИ У ПЕРЕБОЛЕВШИХ ИНФЕКЦИОННЫМ МОНОНУКЛЕОЗОМ ДЕТЕЙ

К.В. Березовская

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск Кафедра поликлинической педиатрии с курсом пропедевтики детских болезней ОГАУЗ ДГБ №2, Поликлиника №2, ОГБУЗ Детская поликлиника №3

Актуальность. Острые респираторные инфекции (ОРИ) снижают резистентность организма ребенка, способствуют наслоению других заболеваний, в том числе инфекционных, которые могут принимать хроническое рецидивирующее течение. Тем самым формируется группа часто болеющих детей (ЧБД).

Цель. Установить частоту острых респираторных инфекций (ОРИ) у детей, перенесших инфекционный мононуклеоз (ИМ) в период с 2011 – 2013 гг., для оценки качества жизни.

Материалы и методы. Проведен анализ 30 историй развития детей, наблюдавшихся в ОГАУЗ Детская городская больница №2 Поликлиника №2 и ОГБУЗ Детская поликлиника №3, в возрасте от 2 до 12 лет. Из них в возрасте от 3 до 7 лет – 22 ребенка, от 7 до 12 лет – 8 детей. Обследование детей включало оценку анамнестических, клинических и параклинических данных, учет частоты и длительности ОРИ до заболевания ИМ и после него, а так же эффективность проводимой терапии.

Результаты. Оценив анамнестические и клинические данные, дети были разделены на

3группы:

1.Дети, имеющие 2 – 3 эпизода ОРИ до и после заболевания ИМ -8 детей

2.Дети, имеющие 5 – 7 эпизодов ОРИ до и 4 – 6 после заболевания ИМ – 14 детей

3.Дети, имеющие 2 – 3 эпизода ОРИ до заболевания ИМ и находящиеся в периоде ранней реконвалесценции (1 – 3 месяца) – 8 детей

1 группа: Перенесли ИМ средней степени тяжести, вызванный вирусом Эпштейн-Барр (ВЭБ) у 3-х, цитомегаловирус (ЦМВ) – у 3-х, и у 2-х неустановленной этиологии. В стационаре получали антибактериальную, противовирусную и симптоматическую терапию. В периоде ранней реконвалесценции продолжали получать противовирусную и симптоматическую терапию с исходом болезни – клиническое выздоровление. После выписки из стационара при возникновении ОРИ получали антибактериальную, противовирусную и симптоматическую терапию. Длительность ОРИ составляла 7 дней.

2 группа: Перенесли ИМ средней степени тяжести, вызванный ВЭБ у 5-х, ЦМВ – у 4-х, и у 3-х неустановленной этиологии, ВЭБЦМВ у 2-х детей. В стационаре также получали антибактериальную, противовирусную и симптоматическую терапию. Выписаны с неполным выздоровлением. В первые 3 месяца у 4 детей после выписки отмечался лимфопролиферативный синдром, у 3 –гепатомегалия с повышением трансаминаз в 1,5 – 3 раза. В период от 6 до 12 месяцев после перенесения ИМ при повторных обследованиях цитолиза не выявлено. ЛОР врачом установлены у 5-х детей аденоидит 2-3 степени, у 2-х хронический тонзиллит. Лечение ОРИ по-прежнему включало антибактериальную, противовирусную и симптоматическую терапию, однако заболевание протекало с большей

318