Жимулёв Курс лекций

Глава 7. Структура гена

Íà

Ðèñ.

7.57.

суммированы

последовательности

могут

иметь

возможные механизмы образования

регуляторные последствия.

многих типов молекул РНК, считываемых

На Рис. 7.58. представлена схема

с одного гена: за счет изменения

альтернативного сплайсинга в гене BR-C

инициации и терминации транскрипции,

у дрозофилы. Весь ген занимает около 120

а также сплайсинга. Использование

т.п.н., в нем выделяют 10 экзонов.

альтернативных промоторов

может

Обнаружено более 15 типов различных

изменять

5'

конец,

использование

ìÐÍÊ.

альтернативных терминаторов может

Другой

òèï

альтернативного

изменять 3' конец транскрипта. Эти

сплайсинга,

когда

îäèí

ãåí

изменения могут организоваться только

функционирует фактически как два (Рис.

инициирующими или терминальными

7.59.). Показаны два транскрипта: Е74А и

последовательностями мРНК. Иногда

Е74В, синтезирующиеся одновременно с

изменения

â

нетранслируемой

5’

двух разных промоторов.

лидерной последовательности или 3’

Альтернативный сплайсинг играет

нетранскрибируемой

трэйлерной

огромную

ðîëü

â

генетическом

определении пола (см. Рис. 13.6.).

Промоторы Экзон 1

Экзон 2

Экзон 3

Экзон 4

Экзон 5 Терминаторы

1

2

3

1

2

3

Использование альтернативных промоторов

Экзоны 1

2

3

4

5

2

3

Промоторы

Использование альтернативных терминаторов

1

2

3

4

5

Терминаторы

1 2

Альтернативный сплайсинг

1	2	3	5
1	4	5	2

Терминатор

2

Рис. 7.57. Схема возможных вариантов альтернативного сплайсинга (Из: Lewin, 1994, p. 688)

7-62

Глава 7. Структура гена

à

á

â

100	120			140	160									180								200			220 ò.ï.í.
экзоны	1				2			3 4 5						6				7			8	9			10
																		z1				z2			z3
								коровый
														экзон

A n

An

An

An

Рис. 7.58. Организация транскрипции гена BR-C у D. melanogaster (Из: DiBello et al., 1991, в кн. Жимул¸в, 1994, стр. 284); а - физическая карта гена (от 100 до 220 т.п.н.); б - расположение экзонов (1-10) на физической карте; в - различные транскрипты, возникающие за счет альтернативного сплайсинга

5’ 0

10

20

30

40

50

60 ò.ï.í. 3’

E74A

E74B

Рис. 7.59. Структура гена Е74, расположенного в пуфе 74EF (Из: Karim, Thummel, 1991, в кн. Жимулев, 1994, стр. 293)

Во время созревания макронуклеуса				содержит 14 экзонов, расположенных в
у инфузорий	происходит	удаление		следующем порядке: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 2, 4, 6,
внутригенных последовательностей без				8, 10, 12, 13, 14, а нормальный по
синтеза РНК. Более того, происходит				нумерации порядок экзонов образуется
престановка	экзонов.	Òàê,	â	в созревшем макронуклеусе (Рис. 7.60.).
микронуклеарной ДНК экзоны гена				7.9.3. Локализация генов в
актина I у Oxytricha nova расположены в
последовательности: 3, 4, 6, 5, 7, 9, 2, 1, 8.				интронах
После удаления “интронов” экзоны				В интронах некоторых генов
занимают положение в ряду с 1 по 9 и				располагаются другие гены (Рис. 7.61 -
только такая их последовательность да¸т				7.63.).
функциональный белок (См. детали:				Удивительным по	сложности
Prescott, 1992).				организации и величине	интронов
Ещ¸ более впечатляет реорганизация				является ген dnc у D.melanogaster. Ген
гена αТВР, который в микронуклеусе				занимает минимум 130 т.п.н. (от -90 до

7-63

																	Глава 7. Структура гена
1					3	5	7 911	2	4	6	8	10 12				13	14
				IES 1
					IES 2	IES 3	IES 4 IES 5 IES 6		IES 7	IES 8 IES 9		IES 10 IES 11 IES 12					IES 13

MDS 14

																		MDS 13			3’ TAS
									IES 13
													IES 7				MDS 4
														MDS 3			IES 2
										MDS 2								IES 8
												IES 1
									IES 12
													MDS 1				MDS 5 IES 3 MDS 6
						MDS 12			IES 6
														5’ TAS			MDS 7
									MDS 11									IES 9
																	IES 4
									IES 11			IES 5 MDS 9
									MDS 10				IES 10					MDS 8			IES 1 - IES 11
																					(369 ï.í.)
																					IES 12 (37 ï.í.)
																					IES 13 (58 ï.í.)
1								2	3		5	6	8	9	11		13				14
									4			7		10		12
																	13				14
1								2	3		5	6	8	9	11
									4			7		10		12
										кодирующий сегмент (1539 п.н.)
теломера ATG																		TGA			теломера

Рис. 7.26. Схема “созревания” гена αТВР у Oxitricha nova.

а - микронуклеарный вариант гена, содержащего 14 экзоноподобных элементов (последовательностей, предназначенных для макронуклеуса - ППМ) и 13 интроноподобных (внутренних элиминируемых последовательностей - ВЭП).

б -Возможная картина образования ДНК-петель для считывани я последовательных ППМ; в - последовательность ППМ после созревания макронуклеус а;

г - зрелый ген с добавленными теломерами

+40 т.п.н.) и содержит 13 экзонов. Между первым экзоном и экзоном, расположенным еще более дистально (около 40 т.п.н.), расположено несколько генов из семейства Pig/Sgs. Между вторым и третьим экзонами (около 70 т.п.н.) располагается еще 4 гена (Рис. 7.63.).

7.9.4. Использование промоторов генов теплового шока

Организацию и экспрессию структурной части генов можно изучать, объединяя их в конструкцию с известным промотором, и трансформируя

7-64

Глава 7. Структура гена

Ген куколочного

кутикулярного белка

47 ò.ï.í.

0.9 ò.ï.í.

3’ ïîëè-À

5’

3’ ïîëè-À 17 ò.ï.í.

Рис. 7.61. Экзон-интронная карта гена Gart и расположенного в его интроне гена куколочного кутикулярного белка дрозофилы (Из: Жимулев, 1994, стр. 147)

R R R B S R

sina

Rh4

Рис. 7.62. Расположение гена sina в интроне гена Rh4 дрозофилы. Вверху - рестрикционная карта района (Из: Carthew, Rubin, 1990, в кн. Жимулев, 1994, стр. 148)

à

á

â

ã

â

á

à

Рис. 7.63. Структура гена dnc у D. melanogaster (Из: Davis, Dauwalder, 1990, в кн. Жимулев, 1994, стр. 149); а - карта интронов и экзонов гена dunce; б - карта других генов, расположенных в интронах гена dunce; в - физическая карта ДНК в районе хромосомы 3С; г - участок хромосомы 3С6 - 3Е5

7-65

Глава 7. Структура гена

дрозофил, мутантных по этому гену. Для этих целей используют промоторы генов теплового шока. В нормальном развитии эти помоторы не функционирует, но активируется при резком повышении температуры (370С на 30 мин) (см. раздел 12.).

Ген под действием шока начинает экспрессироваться, о чем можно судить по “исправлению” мутантного фенотипа, появлению нормального белка или РНК (см. детали: Lawrence, 1992, p. 55).

7.9.5. Участки, терминирующие транскрипцию

Терминация транскрипции прокариотических генов обусловлена элементами, называемые терминаторами. Одним из важных белков, вовлеченных в терминацию транскрипции некоторых генов у E. coli, является белок ρ. Терминаторы в таких генах называются ρ-зависимыми (или терминаторы II типа). Во многих других терминаторах сердцевинная РНК-полимераза сама

может проводить события терминации. Терминаторы такого типа называются ρ- независимыми терминаторами (терминаторы I типа). ρ-независимые терминаторы состоят из последовательностей, расположенных за 16-20 п.н. от точки терминации и представляющих собой инвертированный повтор (Рис. 7.64.).

Эта последовательность замыкается нитью из 4-8 AT-последовательностью, на которой синтезируются цепь из U- последовательностей.

ρ-зависимые терминаторы не имеют AT нити и во многих случаях не формируют шпилечных структур. ρ- фактор - это протеин с двумя доменами: один связывается с РНК, другой домен - с АТФ.

Три ключевые события происходят на терминаторах обоих типов:

1.останавливается синтез РНК,

2.цепь РНК освобождается от ДНК,

3.РНК-полимераза освобождается от ДНК.

Матрица

5’

CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA 3’

(ÄÍÊ)

3’

GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAACTTGTTTT 5’

Транскрипт

5’ CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH 3’

(ÐÍÊ)

A

U

A

U

G

Мутации

C

A

Мутации

A, U

C-G

Транскрипт

A

G-C

A

U

C-G

A, U, C

образует

C-G

A, U

терминирующую

C-G

шпильку	G-C
	5’ CCCA-UUUUUUUU-OH 3’
			Делеция
	G

Рис. 7.64. Последовательность нуклеотидов в ρ-независимом терминаторе транскрипции и структура терминируемой РНК. Мутации в зат емненных участках полностью предотвращают терминацию (Из: Russell, 1998, p. 388)

7-66

Глава 7. Структура гена

7.9.6. Гомология генов

(не расписано)

О гомологии свидетельствует закон гомологических рядов Вавилова. Обладают гомологией:

1.Гены домашнего хозяйства (рРНК, гистонов)

2.Гены, выполняющие одинаковые функции

3.Домены в составе генов (цинковые пальцы, гомео-домен)

4.Гены теплового шока (книга по тепловому шоку Ashburner, Shlesinger)

7.9.7. Псевдогены

(не расписано)

Иногда в геномах встречаются т.н. псевдогены. Они имеют все необходимые черты генов, т.е. полный набор экзонов, характерных для этого гена, поли-А/Т хвост и короткие прямые повторы (как у мобильных элементов) в ДНК мишени.

Псевдоген начинается с 5' точки, эквивалентной 5' точке мРНК, а заканчивается трактом поли-А нуклеотидов, что вероятно имеет происхождение от поли-А конца в молекуле мРНК. (Из: Lewin, 1994, p.10511055, см. также главу 24).

У дрозофилы псевдогены встречаются редко, чаще это гены транспортных или малых ядерных РНК (тРНК, snRNA). Еще один известный пример - псевдоген личиночного кутикулярного белка и псевдоген Adh у D. mulleri, они сохраняют свои интроны. Пример процессированного псевдогена (т.е. без интронов) описан для гена Adh у D. teissieri и D. yakuba.

Литература к разделу 7.9.

Ashburner M. Drosophila. A laboratory handbook. Cold Spring Harbor. Cold SpringHarborLaboratoryPress,1-1331, 1989

Lawrence P.A. The making of fly. Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1- 228, 1992.

Lewin B. Genes V. Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo, 1- 1272, 1994.

Prescott D.M. The unusual organization and processing of genomic DNA in hypotrichous ciliates. TIG 8, N12, 439-445, 1992.

Prescott D.M. The DNA of ciliated protozoa. Microbiol. Rev. 58, N2, 233-267. 1994.

Russell, P.J. Genetics Fifth edition. Addison Wesley Longman, Ins, Menlo Park, California, p. 379-417, 1998.

7-67

Глава 9. Организация и функционирование хромосом

Глава 9. Организация и функционирование хромосом

9.1. Введение	2
9.2.1. Хромосомы вирусов, клеточных органелл и прокариот	2
9.2.2. Геном дрожжей	4
9.3. Митотические хромосомы	5
9.3.1. Идентификация хромосом	5
9.3.2. Кариотип и идиограмма	6
9.3.3. Дифференциальные окраски хромосом	8
9.3.4. “Правило Меллера” и синтения	9
9.4. Эу- и гетерохроматин в митотических хромосомах	11
9.4.1. Компактизация хроматина	12
9.4.2. Дифференциальная окрашиваемость	14
9.4.3. Конъюгация гетерохроматиновых районов	15
9.4.4. Контакты гетерохроматина с ядерной оболочкой	16
9.4.5. Гетерохроматин и хромосомные перестройки	16
9.4.6. Поздняя репликация	17
9.4.7. Варьирование количества гетерохроматина	18
9.4.8. Формирование гетерохроматиновых
районов хромосом в онтогенезе	18
9.4.9. Повторенные оследовательности	19
9.4.10. Генетическое содержание гетерохроматиновых
районов хромосом	22
9.4.11. Заключение	29
9.5. Теломеры и теломерный гетерохроматин	31
9.5.1. Концепция теломеры	31
9.5.2. Строение теломер	34
9.6. Диминуция хроматина и хромосом	43
9.6.1. Диминуция хроматина у аскарид	43
9.6.2. Диминуция хроматина у циклопов	44
9.6.3. Элиминация хроматина у инфузорий	46
9.6.4. Элиминация хромосом у двукрылых насекомых	47
9.6.5. Физиологическое значение диминуции
хроматина и хромосом	48
9.7. Строение центромеры	50
9.8. В-хромосомы	53
9.9. Генетическая инактивация хромосомы у D. miranda	54
9.10. Факультативный и конститутивный
гетерохроматин	54
9.11. Гетерохроматин и клетки зародышевого пути	54

9-1

					Глава 9. Организация и функционирование хромосом
	9. Строение и					А. Вейсман		предположил, что
	функционирование хромосом					наследственность		сосредоточена в
						хромосомах, а доказали это Т.Х. Морган,
	9.1. Введение					К. Бриджес, Г. Меллер и А. Стертевант,
	Хромосомы - это нуклеопротеиновые					завершившие к середине 1930-х годов
	тела, в которых хранится, передается					разработку	хромосомной			теории
	потомству и реализуется наследственная					наследственности.
	информация.					Внастоящеевремянаиболееизвестны
						три типа хромосом:
	По иронии судьбы сначала были
	открыты ядерные структуры, которые в					а. У прокариот в нуклеоиде и в клеточных
	течение многих последующих лет никто не					органеллах у эукариот.
						б. Хромосомы из делящихся клеток
	считал хромосомами. В 1881 году Э.
	Бальбианиописалвклеткахслюнныхжелез					эукариот.
						в. Интерфазные хромосомы эукариот.
	хирономуса	поперечно-исчерченные
	ленты. Их	назвали		“структурами		Литература к разделу 9.1.
	Бальбиани”. Только в 1912 году чешский					Босток К., Самнер Э. Хромосома
	ученый Ф. Рамбоусек предположил, что
	это специализированные хромосомы. А					эукариотической клетки. Москва,
						Мир, 1-598, 1981 (перевод с англ.
	окончательно это название утвердилось в
						издания 1978 года).
	1930-1935 ãã. (D. Kostoff, T. Painter, H.
						Прокофьева-Бельговская А.А. Строение и
	Muller).					функция хромосом в кн. Руководство
	Хромосомы, как “окрашивающиеся
						по цитологии, т.2, Москва-Ленинград,
	тела” были открыты в митотически и
						Наука, стр. 280-329, 1966.
	мейотически	делящихся			клетках
						Прокофьева-Бельговская				À.À.
	классиками цитологии Флеммингом и
	Страсбургером (W. Flemming, 1882; E.					Гетерохроматические				районы
						хромосом.Москва,Наука,1-431,1986.
	Strasburger, 1884). Свое название
	хромосомы	получили благодаря				9.2.1. Хромосомы вирусов,
	способности интенсивно окрашиваться					клеточных органелл и
	основными красителями.					прокариот
	Сам термин “хромосома” предложил
						У ДНК - содержащих вирусов,
	â 1888 ãîäó W. Waldeyer.
						бактерий, сине-зеленых водорослей, а
	Огромное		значение		факта
						такжевсамореплицирующихсяорганеллах
	продольного	расщепления			каждой	клеток	эукариот		(пластидах,
	хромосомы - образование хроматиды - в					митохондриях		è	центриолях)
	процессе деления клетки отметил в тот же					хромосома представляет собой голую
	период В. Ру (W. Roux, 1883). С					двуспиральную молекулу ДНК.
	удивительной интуицией он указал, что					У большинства форм эта молекула
	подобный способ деления хромосом
						образует кольцо, которое закручено в
	свидетельствует о присутствии в них					шпильку,	и хромосома			имеет
	жизненно важных для клетки элементов и					суперспирализованный вид (Рис. 9.1.).
	о расположении		ýòèõ	элементов в

линейном порядке.

9-2

Глава 9. Организация и функционирование хромосом

Репликация этих хромосом начинается с единственной определенной точки (точки инициации репликации) и прогрессирует, пока не закончится репликация всей хромосомы: таким образом, хромосома представляет собой единицу репликации-репликон. В большинстве случаев, а у бактерий - всегда, репликация хромосомы идет одновременно в обе стороны от точки инициации репликации (т.и.р.) (Рис. 9.2.).

Репликация хромосом вирусов и прокариот протекает быстро, со скоростью порядка 30 микронов в минуту. У прокариот хромосома прикреплена одной точкой к клеточной мембране, и после репликации расхождение дочерних хромосом осуществляется раздвиганием этих точек вследствие роста мембраны.

Ðèñ.	9.1.	Кольцевая			è
суперспирализованная				форма
молекулы ДНК у бактерий
		ò.è.ð.
Репликация				Репликация
		ò.è.ð.
Ðèñ.	9.2.	Схема	репликации
кольцевой ДНК

Длина молекул ДНК, служащих хромосомами у вирусов, прокариот и клеточных органелл, варьирует (Табл. 9.1.).

В результате полного секвенирования геномов некоторых бактерий длины кольцевых молекул ДНК и числа генов определены по данным на 1 сентября 1998 года: у Bacillus subtilis длина ДНК составляет 4214,814 т.п.н. и геном содержит около 4100-4220 генов, у E. coli – 4639,221 т.п.н. и, соответственно, примерно 4290 генов (Рис. 9.3.).

У бактерий геном организован в некое тело или тела, которые выглядят довольно компактными и занимают около трети обьема клетки. Эти тела называют нуклеоидами. ДНК в бактериальном нуклеоиде находится в ассоциации с ДНКсвязывающимися белками:

1.Белок HU конденсирует ДНК, возможно заворачивая ее в бусоподобные структуры. Он стимулирует репликацию ДНК.

2.Белок H1 связывается с ДНК, взаимодействуя прежде всего с теми последовательностями, которые изогнуты. Функции белка неизвестны.

Табл. 9.1. Размеры кольцевой молекулы ДНК - хромосомы у вирусов, прокариот и в клеточных органеллах эукариот (Из: Алиханян и др. 1985, стр. )

		Длина
Кольцевая
молекула ДНК			ïàðû
	микрометры
			нуклеотидов
Мелкие вирусы,	0,4-1,0		1200-3000
центриоли
Другие вирусы,
пластиды,	5-100		15000-300000
митохондрии
Бактерии	1000-2000		3000000-6000000

9-3

Глава 9. Организация и функционирование хромосом

Рис. 9.3. Сопоставление генетической карты (снаружи круга) и длины кольцевой молекулы ДНК (в т.п.н.) у E. coli (данные из Internet на 1 сентября 1998 года )

3.Белок P был секвенирован и по последовательности аминокислот напоминает протамины, которые связываются с ДНК в сперматозоидах некоторых видов. Предполагается, что P - это ДНК-связывающийся белок, однако функции его не известны. ДНК в нуклеоиде составляет около 80% (для сравнения у эукариот - только 50%). Она свернута в петли, примерно по 40

т.п.н. в каждой петле (Рис. 9.4.). Основания петель защищены с

помощью какого-то неизвестного механизма, что предотвращает передачу

Рис. 9.4. Петлевая организация ДНК у бактерий

вращения ДНК с одной петли на другую. В геноме примерно 100 таких петель - или доменов. (см. детали: Lewin, 1994, pp. 772776).

Литература к разделу 9.2.

Алиханян С.И., Акифьев А.П., Чернин Л.С. Общая генетика. Москва, Высшая школа, 1-446, 1988.

Lewin B. Genes V, Oxford, New York, Tokyo, Oxford University Press, 1- 1272, 1994.

9.2.2. Геном дрожжей

Хромосомы этих низших эукариот не видны под микроскопом, однако по генетическим данным выделяют 16 групп комплементации. Геном дрожжей

Saccharomyces cerevisiae к настоящему времени полностью секвенирован. Общая длина ДНК в геноме составляет 13390 т.п.н., варьирование хромосом по длине показано на Рис. 9.5.

В геноме выявлено около 6085 генов.

9-4