2. Механизмы и типы трансмембранного переноса.

Перенос веществ через эпителий осуществляется по двум путям — межклеточному и трансклеточному. Однако объем переноса через клетки, как правило, оказывается намного большим, чем объем переноса по межклеточному пути. Кроме того, источником энергии для переноса всегда является транспорт через клетки. Поэтому вначале мы рассмотрим закономерности трансклеточного пути. Как уже говорилось, перенос веществ через клетки состоит главным образом из двух этапов: пересечения апикальной и базолатеральной мембран — в этом порядке для всасываемого вещества и в обратном — для секретируемого. Итак, говорить о переносе веществ через клетку — значит говорить о переносе веществ через мембраны.

2.1. Термодинамические аспекты трансмембранного переноса.

Ионный состав цитоплазмы весьма сильно отличается от состава внеклеточной жидкости (см. Табл. 1). Различие в концентрациях растворов по разные стороны мембраны называют концентрационным градиентом¹. Очевидно, что вещества стре­мятся перемещаться из раствора с более высокой их концентрацией в раствор с менее высокой концентрацией, в направлении, противоположном концентрационному градиенту². Не вдаваясь в подробности, заметим, что определенному различию в концентрациях соответствует определенная энергия, которую приходится затрачивать на перенос 1 моля вещества из менее концентрированного раствора в более концентрированный (т.е. против концентрационного градиента, в смысле, принятом физиологами) и которая освобождается при переносе в противоположном направлении (по концентрационному градиенту в смысле, принятом физиологами). Эту энергию называют разностью химических потенциалов.

Далее, на мембране существует разность электрических потенциалов, при этом ее внутренняя сторона заряжена отрицательно. Величина этой разности потенциалов для разных клеток (и мембран) различна, но, как правило, находится в интервале -40 — -100 мВ. По закону Кулона, положительно заряженные ионы стремятся двигаться в сторону отрицательного заряда (т.е. в клетку), а отрицательно заряженные — в сторону положительного (т.е. из клетки). Энергия, требуемая для переноса частицы против электрического потенциала равна произведению разности потенциалов на заряд частицы:

,

где Q — заряд частицы, U — разность электрических потенциалов.

Заметим, что в некоторых случаях знак разности химических потенциалов совпадает со знаком разности электрических потенциалов для данного иона (так, ионов натрия мало в клетке и много вне клетки, поэтому по концентрационному градиенту он стремится войти в клетку; он положительно заряжен и поэтому стремится войти в клетку по электрическому потенциалу), в других случаях эти знаки противоположны (так, калия много в клетке и мало вне клетки, так что по концентрационному градиенту он стремится выйти из клетки, но он положительно заряжен и по электрическому потенциалу стремится войти в клетку). Алгебраическая сумма электрического и химического потенциалов называется электрохимическим потенциалом. Если электрохимический потенциал равен 0, вещество находится в равновесии, т.е. не стремится перемещаться через мембрану. Так, в большинстве клеток в физиологических условиях в покое калий находится в концентрациях, близких к равновесным и не стремится перемещаться через мембрану. Очень важно понимать, что равновесное распределение для заряженных частиц отличается от равномерного. Так, для K⁺ при заряде мембраны -90 mV и концентрации во внешней среде 5 ммоль равновесию соответствует внутриклеточная концентрация 146 ммоль.

Понятно, что если транспорт через мембрану осуществляется против электрохимического потенциала, он идет с затратами энергии; в противном случае энергия освобождается. Таким образом, некоторые вещества приходится переносить через мембраны с затратой энергии, или, как говорят физиологи, осуществляя активный транспорт. Очевидно, для этого на мембране должны находиться специальные структуры — переносчики.

2.2. Транспортные белки мембран, их функция и классификация.

Выше мы показали, что трансмембранный перенос веществ против электрохимического потенциала требует существования специальных мембранных структур, способных активно транспортировать молекулу. А как обстоят дела, если некоторое вещество перемещается по градиенту, не требуя затрат энергии? (В таких случаях говорят о пассивном транспорте.)

Поскольку мембрана представляет собой бислой липидов, простая диффузия водо-растворимых веществ и воды через нее происходит с ничтожно малой скоростью. Поэтому их перенос всегда осуществляется при помощи специальных белковых структур. Эти структуры подразделяются на два основных класса: каналы и переносчики (синоним: транспортеры).

Каналы — это белки, состоящие обычно из нескольких субъединиц и образующие поры, пронизывающие бислой липидов (Рис.2). В открытом состоянии они пропускают молекулу или ион через мембрану. Проходящая молекула не взаимодействует с белком достаточно сильно, чтобы изменить его конформацию. Благодаря этому, транспорт может осуществляться с достаточно высокой скоростью. Дело в том, что продолжительность нахождения иона в канале намного меньше, чем промежуток между моментами, когда молекулы переносимого вещества приближаются к каналу. Следовательно, именно длительности этих промежутков определяют скорость транспорта. В то же время, частота столкновений молекул субстрата со входом в канал, очевидно, определяется концентрацией субстрата. Следовательно, скорость транспорта через канал почти линейно зависит от концентрации переносимого вещества. (Более подробно об этом – Рис. 4.) В типичном случае при физиологических условиях, одиночный канал пропускает 10⁷-10⁸ ионов в секунду. Разные мембранные каналы отличаются по следующим характеристикам:

1. Селективность — способность пропускать только определенные молекулы или ионы. Так, известны высокоселективные натриевые каналы, высокоселективные калиевые каналы, низкоселективный катионный канал; существуют хлоридные каналы, водные каналы (аквапорины) и т.д.

2. Проницаемость — отношение скорости диффузии через канал к электрохимическому градиенту.

3. Условия открытия/закрытия канала. Существуют (и играют ключевую роль в возбуждении клетки) потенциал-зависимые натриевые каналы, которые открываются при снижении трансмембранной разности электрических потенциалов, существуют каналы, связанные с мембранными рецепторами к нейромедиаторам и гормонам, имеются каналы, открывающиеся при осмотическом сморщивании или набухании клетки...

Приведем несколько примеров. Потенциал-чувствительный низкоселективный натриевый канал является одним из главных участников процесса возбуждения клетки. Второй его участник — высокоселективный калиевый канал. Хемовозбудимый (ацетилхолин-чувствительный) натриевый канал более известен под именем н-холинорецептор, два его подтипа имеются в нервно-мышечных синапсах и в ганглиях вегетативной нервной системы. Потенциал-чувствительный Ca⁺⁺-канал встречается, в частности, в мышечных клетках. При изучении транспорта жидкости и ионов через эпителий мы будем интересоваться в основном эпителиальным Na⁺ каналом, эпителиальным Cl^- каналом и эпителиальным K⁺ каналом.

Переносчики, в противоположность каналам, связываются с транспортируемым веществом, меняя при этом свою конформацию таким образом, что участок (сайт) связывания вместе с перемещаемой молекулой пересекает мембрану. Транспорт при помощи переносчиков обычно принципиально медленнее, чем диффузия через каналы (В типичном случае, переносчик транспортирует не более 1000 молекул в секунду), и его скорость определяется скоростью конформационных превращений. Поэтому зависимость скорости транспорта с помощью переносчиков от концентрации переносимого вещества имеет характер кривой насыщения в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен (Рис. 4). Это вызвано тем, что при высокой концентрации субстрата молекула транспортера оказывается связана с субстратом в течение длительного времени, которое оказывается сравнимым, или большим, чем продолжительность промежутков между освобождением транспортера от перенесенной молекулы и связыванием следующей. В такой ситуации повышение концентрации субстрата приводит к тому, что транспортер практически все время оказывается связан с его молекулами и дальнейший рост скорости транспорта становится невозможным.

Эта особенность транспорта с помощью переносчиков имеет важное физиологическое значение. Так например, глюкозо-нат­ри­евый котранспортер проксимального почечного канальца достигает своей максимальной пропускной способности при концентрации глюкозы около 12 ммоль/л, и дальнейший ее рост приводит к тому, что она не успевает реабсорбироваться и, следовательно, теряется с мочой. На этом основан, в частности, тест на глюкозу в моче при диагностике сахарного диабета.

Подобно каналам, транспортеры характеризуются определенной селективностью, которая может быть как очень высокой (например, у Na⁺/K⁺-АТФазы), так и весьма низкой (например, у почечного переносчика органических кислот).

Преимущество переносчиков над каналами состоит в том, что они могут перемещать вещества против электрохимического градиента. Энергия для переноса может обеспечиваться непосредственным гидролизом АТФ — это так называемый первично активный транспорт. В большинстве случаев первично активные транспортеры являются электрогенными: при их работе происходит перемещение заряда, в результате чего на мембране возникает разность потенциалов. Классическим примером первично активного транспортера является Na⁺/K⁺-АТФаза, которая, используя энергию гидролиза АТФ, перемещает в клетку (против концентрационного градиента) 3 иона Na⁺, в обмен на 2 иона K⁺. Стехиометрия 3:2 означает, что при каждом обороте этот фермент переносит через мембрану, из клетки, один положительный элементарный заряд, что приводит к накоплению в клетке отрицательного заряда. Первично активные транспортеры нередко называют ионными насосами.

Таким образом, первичные активные транспортеры генерируют напряжение и создают трансмембранные ионные градиенты. Вторично активные транспортеры используют такие градиенты в качестве движущей силы для транспорта. Механизм вторично активного транспорта более сложен, поэтому его стоит рассмотреть подробнее. Примером может служить транспорт глюкозы из просвета кишки или проксимального почечного канальца в кровь. Как известно, в норме глюкоза извлекается из мочи практически полностью, тогда как в крови ее концентрация составляет приблизительно 5 ммоль/л. Таким образом, транспорт осуществляется против концентрационного градиента и не может обеспечиваться пассивной диффузией. Поэтому транспорт глюкозы здесь осуществляет специальный переносчик, глюкозо-натриевый котранспортер. Он связывает ионы натрия и молекулу глюкозы с внешней стороны мембраны и «перебрасывает» их внутрь. Натрий при этом перемещается по электрохимическому градиенту, освобождая энергию — которую переносчик и использует для транспорта глюкозы. Электрохимический градиент для натрия, который был здесь использован, поддерживается благодаря его первично активному транспорту натрий-калиевым насосом. В силу этого, использующий его транспорт глюкозы разумно назвать вторично активным. Существуют две изоформы этого переносчика: SGLT1, перемещающий натрий и глюкозу в соотношении 2:1 и характеризующийся высоким сродством к глюкозе и SGLT2, перемещающий субстраты в отношении 1:1 и имеющий на порядок меньшее сродство к глюкозе. По современным данным, SGLT1 гораздо более распространен и имеет большее физиологическое значение для транспорта глюкозы, особенно в кишечнике. Однако мы приводим для иллюстрации менее сложную схему работы SGLT2 (рис. 3).

Переносчики, осуществляющие сопряженный транспорт, могут перемещать вещества в одном и том же направлении, как только что описанный глюкозо-натриевый транспортер (такие переносчики называются котранспортерами), или в противоположных (тогда они называются обменниками). Тех и других существует довольно много. Так, можно привести примеры натрий-бикарбонатного ко­транспортера, натрий-калий-двуххлорного котранспортера, ко­транс­портеров натрия и аминокислот, натрий-хлоридного котранспортера; натрий-про­тон­но­го обменника, бикарбонат-хлоридного обменника и других. Возможно, читая этот список, Вы уже заметили одну закономерность: обычно котранспортеры переносят разноименно заряженные ионы, тогда как обменники — одноименно заряженные. Это не случайно — таким образом удается избежать затрат энергии, связанных с переносом заряженного иона против электрического градиента. Впрочем, котранспорт или обмен не обязаны быть электронейтральными. Так, натрий-бикарбонатный котранспортер имеет стехиометрию 3HCO₃^–:1Na⁺, что обеспечивает перенос двух элементарных зарядов за один цикл работы. Благодаря тому, что клетка заряжена отрицательно, а разность концентраций для HCO₃^– между клеткой и внеклеточной жидкостью не особенно велика (см. Таблицу 1), бикарбонат стремится покинуть клетку, и перемещение трех его ионов по электрохимическому градиенту используется этим транспортером для переноса одного иона натрия против градиента. Расчет показывает, что стехиометрия 2:1 приводила бы к транспорту в противоположном направлении, так как тогда энергия переноса иона натрия оказывалась бы большей, чем энергия переноса двух ионов бикарбоната. Таким образом, при сопряженном транспорте направление переноса определяется соотношением энергии переноса транспортируемых веществ.

Кроме первично и вторично активных, встречаются еще транспортеры, осуществляющие перенос единственного типа веществ по электрохимическому градиенту, облегчая ему переход через мембрану. Этот подвид пассивного транспорта называется облегченной диффузией. Примером такого пассивного переносчика может служить транспортер глюкозы в эритроцитах.

Кроме транспортных характеристик каналов и транспортеров, весьма важным их свойством является чувствительность к разнообразным ингибиторам и стимуляторам. Так, некоторые бактериальные токсины действуют, прямо или опосредованно стимулируя активность каналов. Так же действуют и многие фармакологические препараты, в частности, диуретики. Кроме того, применение ингибиторов и стимуляторов транспорта является важным инструментом исследования мембранного транспорта.

Следует иметь в виду, что все разнообразие задач, которые встают перед различными транспортными эпителиями, решается с помощью разных сочетаний одних и тех же транспортных белков, набор которых достаточно ограничен. Список основных известных в настоящее время мембранных транспортеров и каналов, вместе с их транспортными характеристиками, а так же специфическими стимуляторами и ингибиторами приведен нами в Таблице 2.

П



еренос веществ через мембрану может осуществляться через мембранные каналы и с помощью транспортеров, которые могут быть пассивными, переносящими вещества по электрохимическому градиенту (облегченная диффузия), первично активными (использующими для переноса гидролиз АТФ) и вторично активными (использующими сопряженный транспорт). Сопряженный транспорт может осуществляться в одном направлении (котранспорт) или в противоположных (обмен); он может сопровождаться переносом электрического заряда (быть электрогенным) или не сопровождаться им (быть неэлектрогенным). Направление переноса при сопряженном транспорте определяется тем веществом, для которого энергия переноса оказывается большей. Главными характеристиками транспортера являются источник энергии переноса, селективность, стехиометрия транспорта и его скорость (число оборотов в секунду).