25.Аппаратурное оснащение процессов выделения и очистки продуктов микробного синтеза.

На стадии выделения продукта главная задача — отделить основную часть продукта, пусть даже и с некоторыми примесями. Получается как бы неочищенный продукт. Поэтому, когда необходимо получать биопродукты высокой кондиции, добавляют еще стадию очистки продукта. Задача этой стадии — убрать примеси и сделать продукт максимально чистым.

Эта задача решается с помощью разнообразных процессов, в которых многие из тех, что уже были рассмотрены ранее (экстракция и экстрагирование, адсорбция, ионный обмен, ультрафильтрация и обратный осмос, ректификация и ферментолнз). Кроме этих процессов используют и следующие.

Хроматография — процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, но не одно, а несколько, часто близких по структуре. Например, смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков. При адсорбции они и абсорбируются вместе. А вот при хроматографии они выходят из сорбента как бы по очереди, что и позволяет их разделять и, значит, очищать друг от друга.

Диализ — процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут проходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от солей и низкомолекулярных растворимых примесей.

Кристаллизация. Этот процесс базируется на различной растворимости веществ при разных температурах. Медленное охлаждение позволяет формировать кристаллы из растворов целевых продуктов, причем чистота их обычно очень высока. Вся «грязь» остаётся в маточном растворе. Таким образом, например, получают кристаллы пенициллина.

Можно даже получить еще более чистый продукт, если кристаллы растворить в воде или растворителе, а потом снова кристаллизовать (т. е. провести процесс перекристаллизации).

26. Основные технологические схемы выделения целевого продукта в зависимости от его локализации. Примеры.

26. Основные принципы культивирования микроорганизмов. Характеристика.

Принципы культивирования микроорганнзмов. С момента внесения микробов (засева) в питательную среду имеет место индукция их физиологической активности, особенно — в логарифмическую и/или стационарную фазы размножения. При этом одновременно сопряженно протекают многие реакции, катализи-руемые иммобилизованными или свободными ферментами. В реакции, особенно — на первых зтапах, нередко вовлекаются высокомолокулярные вещества с определенной конфигурацией молекул (сравнить такие источники утлерода как глюкоза и крахмал или источники азота—аммония сульфат, какая-либо аминокислота и нативный белок). Поэтому следует учитывать специфику выращивания микроорганизмов.

Главные особеиности культивирования микробов в целях получения большинства первичиых и вторичных метаболитов следующие;

1. необходимость применения специальных биореакторов вместимостью 63, 200, 1000 и более м³, в которых возможно поддержание асептических условий в течение сравнительно длительного времени;

2. видовые различия биообъектов, с которыми связаны специфические характеристики питательных сред, кардииальные точки (минимальные, оптимальные и максимальные) температуры и рН;

3. невозможность одновременного поддержания постоянства критериев химического, теплового, диффузионного и гидродинамического подобия, с чем связаны трудности масштабирования биотехнологических процессов;

4. различия в массообмеиных процессах у аэробов и анаэробов — культивирование аэробов осуществляют в трехфазных системах ["твердое тело (клетки)-жидкость-газ"], анаэробы выращивают в виде двухфазных систем ["твердое тело (клетки)-жидкость"];

5. необходимость неремешивания культуральньгх жидкостей в целях улучшения массообмена (кислорода воздуха для аэробов — прежде всего), а это, в свою очередь, индуцирует пенообразование и, как следствие, диктуетнеобходимость прибегать к пеногашению;

6. микроорганизмы чувствительны к воздействию механических, физических и химических факторов;

7. при микробном синтезе целевых лродуктов имеют место индукция, активация, ингибирование, репрессви и некоторые дру-гие регуляториые процессы, усложняющие в целом регуляцию размножения продуцсита и биосинтез им конечного продукта;

8. скорость биосинтеза целевых продуктов более медлеиная по сравнению со скоростями химического синтеза;

9. отдельные виды микроорганизмов, используемых в биотех-нологических процессах, являются болезиетворными и работа с ними должна проводиться с особой тщательностью (дифтерийные и столбнячные палочки, микобактерии туберкулеза, холерный вибрион и др.);

10) некоторыс представители микробного мира должны культивироваться только на (в) живых тканях/клетках (куриные эмбрионы, клетки человека и животных и т. д.); к таким представителям можно отнести вирусы, риккетсии.

Любой биотехнологический процесс реализуют условно в два этапа. Первый из них — предферментация, когда необходимо выполнить все подготовительные работы для реализации второго зтала — ферментации, то есть накопить и выделить целевой продукт.

Предферментация

Это этап включает подготовку питательных сред, биообъекта, воздуха для аэробов и биореактора. Компоненты питательных сред подбирают на основании расчета материального баланса, связанного с трансформацией того или иного источника питания в клеточную биомассу и/или метаболит при учете расхо-дуемой (выделяемой) энергии. Обычно качественный и количественный составы питательных сред указаны в регламентной документации.

Питательные среды, испольэуемые на подготовительном этапе, могут несколько отличаться от среды, применяемой на втором этапе. Так, например, при пересеве лиофильно высушенной ма-точной культуры обычно рекомендуют обогащенные питательными ингредиентами жидкие среды. Последующие пересевы осуще-ствляют вначале на агаризованную ферментационную среду, а затем — на жидкую.

На всех этапах подготовки биообъекта питательные среды перед их засевом должны быть сгерильными. Биообъект, или промышленный штамм в идеале должен удовлетворять основным требованиям:

1) стабильность структурно–морфологических признаков и физиологической активности при длительных хранении и эксплуатацйи в производстве;

2) повышенные скорости роста и биосинтеза целевого(-ых)продукта(-ов) в лабораторных и проигтодственных условиях;

3. достаточно широкий диапазон устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов (колебания температуры, рН, аэрация, перемешивание, вязхость срсды);

4. умереиная требовательность к ограниченному числу источников питания; чем более широкий набор источников углерода, азота и других элементов может использовать проиэводственный штамм, тем легче его культивировать и с большей экономической выгодой.

В действительности каждыЙ штамм имеет свои особенности и не по всем показателям отвечает вышелеречисленным требованиям. Как правило, чем богаче усвояемыми ингредиентэми питательная среда, тем лучше растет и метаболизирует на(в) ней микроорганизм. Уже многие годы используют кукурузный экстракт в качестве добавки к питательным средам, поскольку он богат не только источниками углерода и азота, но также микроэлемеитами и витаминами. Сухие вешества в нем составляют 45—55%, в их состав входят зольные вещества —. 1,5—4,5%.

Не менее часто применяют дрожжевой экстракт из клеток Saccharomyces cerevisiae, богатый различными веществами —аминокислотами (аргинином — 5%, валином — 5,5%, гистидином — 4%, изолейцином — 5,5%, лейцином — 7,9%, лизшюм — 8,2%, метионином — 2,5%, тирозином — 5%, треонином — 4,8%, трипто-фаном — 1,2%, фенилаланином — 4,5%, цистином — 1,5%) и витаминами (биотином — 0,06%, инозитом — 0,3%, кальция пантотенатом — 0,01%, кислотой р-аминобензойной — 0,016%, кислотой никотиновой — 0,059%, кислотой фолиевой — 0,001%, пиридоксина монохлоридом — 0,002%, рибофлавином — 0,01%, тиамина монохлоридом - 0,017%, холянхлоридом — 0,27%) в расчете на сухое вещество. К тому же в биомассе клеток дрожжей содер-жится до 50% белков.

Вместо экстракта можно лобавлять автолизат или гидролизат дрожжей.

Объемное и дозирующее оборудование для измерения, транспортировки и загрузки биореакторов аналогично оборудованию, применяемому, например, в пищевой (или вхимической) промыш-ленности: различных типов весы, насосы (например, вакуумные), транспортеры (ленточные, шнековые), элеваторы, контейнеры и др. Газообразные и жидкие продукты обычно подают в биореакторы по системам стерильных трубопроводов. В крупномасштаб-ном производстве питательиыс среды и некоторые их компоненты стерилизуют нагреванием и/или фильтрованием чсрсз пористые мембраны. Тепловая стерилизация может быть периодической и непрерывной; в биотехнологии применяют оба вида стерилизации.

В случае получения лекарствениых средств, например, антибиотиков для парентерального введения, необходима исключительно высокая степень стерильиости питательных сред и целевых про-луктов. При этом необходимо стремиться снизнть, например, вероятность выживания бактериальиых спор до всличииы менее 10^–12, исходя из уравнения:

Понятно, что перед засевом биообъекта стерильными должны быть и питательная среда и биореакторы. Стерилизацию биореакторов часто проводят одновременно со стерилизацией питательной среды в них.

Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В заводской или цеховой лаборатории должна быть подготовлена культура для последующей наработки инокулюма (инокулята), или поссвного материала. В этих целях исходный штамм микроорганизма, сохраняемый в условиях, близ-ких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной суш-ки) оживляют прсле добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду. Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чисток, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить род-ственные связи), операции по пересеву штамма на среду возраста-ющих объемов (площади) повторяют нссколько раз и проводят в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам, помещаемым на качалочные устройства (шотгель-аппараты).

Последующую подготовку биооб-ьекта осуществляют в цсхе, используя неболыиие ферментаторы-инокуляторы, в которых наращивают посевной материал ддя промышленных ферментаций. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины — окончания Log-фазы, то есть когда клетки делятся синхронно. Известно понятие степень синхронизации, то есть степень участия клеток популяции в синхронном делении (О.Шербаум, 1959—1960), выражающаяся в индексе синхронизации (Is):

При необходимости синхронизацию деления можно индуцировать, например, метаболическим шоком (предварительный посев культуры на голодные среды), температурным шоком (смена температур, в частности, пониженных в начале на оптимальные в последующем), или используя одинаковые ио размеру клеткн, механически разделенные, например, фильтрованием (селективные методы) и т. п.

В зависимости от плотности суспензии ее необходимое количество может достигать 1—20% объема производственного ферментатора. Для аэробных микроорганизмов в инокулятор доставляют очищенный стерильный воздух.

Ферментация

Второй зтап биотехнологического процесса, называемый ферментацией. проводят в производственных биореакторах. По биохимической сущности он во многом имитирует предферментацию и поэтому названный термин является условным. Тем не менее, он принят на практике и в специальной литературе и не нуждается в каких-либо дополнительных пояснениях.

В процессе ферментации также необходимо использование стерильных питательных сред, воздуха и биореакторов, выбор которых обусловлен особенностями культивируемых микроорганизмов.

Микроорганизм в виде суспензии определенной плотности подают из инокулятора(-ов) в промышленный биореактор, или ферментатор, в котором содержится стерильная жидкая питательная среда. При этом не должно произойти попадания каких-либо посторонних микробов в питательную среду вместе с продуцентом — все соединения системы должны бьпъ герметично закрытыми.

Общий объем ферментатора заполняют инокулированной средой на 70—80%, 20—30% объема заполняют газами (инертным — для анаэробов, воздухом — для аэробов).

Аэрация жидкости способствует пенообразованию, снижающему качестяо ферментации, поэтому используют пеногашение либо механическое (установка в верхнеи части ферментатора специальной дополнительной мешалки), либо физико-химическое (использование ПАВ для снижения поверхностного натяжения на границе раздела фаз "газ-жидкость'').

Длительность ферментаций колеблетея в пределах от 4—5 до 14 суток и дольше, что зависит от особенностей физиологической активности биообъектов. Применительво к биосинтезу антибиотиков и экзогликанов периодические ферментации проводят обычно в течение 4—5 суток.