3.2. Методика определения белковых фракций методом электрофореза на бумаге.
ПРИНЦИП МЕТОДА: Метод основан на различии величины заряда белков сыворотки крови. Если нанести каплю сыворотки на полоску хроматографической бумаги, смоченной буферным раствором, и пропустить через эту полоску постоянный электрический ток, отдельные белки будут продвигаться в электрическом поле с различной скоростью. При рН=8,6 белки сыворотки крови движутся по направлению к аноду, поскольку они обладают в этих условиях отрицательным зарядом. Наиболее быстро движутся альбумины, затем 1- и 2-глобулины, далее - глобулины и наконец - глобулины.
АППАРАТУРА: Прибор для определения белков в крови методом электрофореза на бумаге состоит из выпрямителя, электрофоретической кюветы и денситометра.
ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ:
Кюветы заполняются вероналовым буфером рН = 8,6. Нарезают из хроматографической бумаги полоски длиной 38 см., шириной 3 см., полоски смачивают буферным раствором и помещают в кювету. Ближе к отрицательному полюсу наносится сыворотка (0,01 мл), затем прибор включается в электрическую сеть.
Электрофоретическое разделение белков сыворотки на бумаге производится обычно в течение 6- 24 часов при напряжении 150 Вт и силе тока 6-8 А. По истечении указанного срока бумажные полоски сушат в сушильном шкафу при температуре около 100 градусов в течение 5 мин., затем красят бромфеноловым синим. Остатки красителя, не связавшегося с белками, отмывают с полоски бумаги 10% уксусной кислотой.
Количественное определение белковых фракций проводится с помощью денситометра или путём экстрагирования спиртовым раствором щелочи с последующим определением концентрация краски фотоколориметрически.
Тема: Биохимия крови. Метаболизм гемоглобина. Занятие №2.
Актуальность темы.
Минеральный состав крови чрезвычайно разнообразен и играет большую роль в жизнедеятельности организма, например, в процессе роста и развития ребенка обмен кальция и связанных с ним фосфатов. Снижение содержания кальция может сопровождаться повышением нервно-мышечной возбудимости, судорогами (тетания новорожденных). Развитию гипокальциемии у новорожденных способствует сахарный диабет у матери, недоношенность и т.д. Чрезмерные дозы витамина «Д» вызывают гиперкальциемию с отрицательными последствиями для организма.
Основным белком, осуществляющим снабжение тканей кислородом и освобождение их от углекислоты, является гемоглобин. В связи с этим, изучение обмена гемоглобина и определение его концентрации является чрезвычайно важным, а также актуальным является клиническое значение определения содержания желчных пигментов крови, моче и кале в дифференциальной диагностике различных видов желтух (гемолитическая, желтуха новорожденных, обтурационная, паренхиматозная).
2. Основные вопросы темы:
Минеральные составные части крови, значение их для организма.
Различают несколько фракций кальция: ионизированный кальций, кальций неионизированный, но способный к диализу, и недиализирующийся (недиффундирующий), связанный с белками кальций.
Кальций принимает активное участие в процессах нервно-мышечной возбудимости (как антагонист ионов К+), мышечного сокращения, свертывания крови, образует структурную основу костного скелета, влияет на проницаемость клеточных мембран и т.д.
Отчетливое повышение уровня кальция в плазме крови наблюдается при развитии опухолей в костях, гиперплазии или аденоме паращитовидных желез. В таких случаях кальций поступает в плазму из костей, которые становятся ломкими.
Важное диагностическое значение имеет определение уровня кальция при гипокальциемии. Состояние гипокальциемии наблюдается при гипопаратиреозе. Нарушение функции паращитовидных желе приводит к резкому снижению содержания ионизированного кальция в крови, что может сопровождаться судорожными приступами (тетания). Понижение концентрации кальция в плазме отмечают также при рахите, спру, обтурационной желтухе, нефрозах и гломерулонефритах.
Механизм свертывания крови.
Система свертывания крови представляет собой каскадную цепь протеолитических реакций.
Каскадность реакций обеспечивает постепенное усиление первоначального слабого сигнала – воздействия, вызывающего активацию внутреннего и внешнего пусковых механизмов свертывания. Каждая последующая стадия приводит к образованию все больших количеств активной формы очередного фактора. Происходит лавинообразное нарастание «мощности» каждой следующей ступени каскада, в результате стадия превращения фибриногена в фибрин протекает очень быстро.
Первая стадия – сокращение поврежденного сосуда.
Вторая стадия – образование белого тромба. Протромбин (VII фактор) под действием тромбопластина (III) тромбоцитов и ионов кальция (IV) превращается в активную форму – тромбин. В этой стадии участвуют факторы внешнего пускового механизма свертывания: проконвертин (VII); проакцелерин (V); фактор Стюарта (Х), а также факторы внутреннего пускового механизма свертывания: фактор Кристмаса (IХ); фактор Розенталя (ХI); фактор Хагемана (ХII)
Третья стадия – образование красного тромба. Тромбин активирует фибриноген (I), превращая его в активную форму фибрин – мономер. Затем образуется фибрин – полимер (фибриновый гель), который не отличается прочностью. Его легко может разрушить механическое воздействие. Под действием фермента трансглутаминазы (ХIIIa) образуются прочные ковалентные связи между мономерами фибрина, а также между фибрином и белком фибронектином, стабилизируя гель фибрина.
Через час тромб сжимается (ретракция тромба). Затем происходит фибринолиз (четвертая стадия). Плазминоген под действием фермента урокиназы и тканевого активатора плазминогена (ТАП) превращается в активную форму – плазмин (частичный протеолиз), который расщепляет в фибрине – полимере пептидные связи.
Тромб в течение нескольких дней рассасывается.
Роль витамина К в свертывании крови.
Витамин К входит в состав ферментов, катализирующих карбоксилирование глутаминовой кислоты с образованием γ-карбоксиглутаминовой кислоты, входящей в состав факторов свертывания крови: II, VII, IХ, Х.
Противосвертывающая система.
Ингибиторы факторов свертывания крови:
белок плазмы антитромбин III, инактивирующий большинство факторов свертывания крови;
другие белки – ингибиторы протеиназ (α- макроглобулин, антиконвертин, тромбомодулин).
Антикоагулянты:
гепарин, активирующий антитромбин III;
антивитамины К – дикумарин, неодикумарин и др.
Метаболизм гемоглобина. Синтез гема, гемоглобина.
