35 В основе этой реакции лежит способность специфической антитоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин.

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.

Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

Для проведения реакции исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свинкам, мышам). Контрольным животным вводят фильтрат исследуемого материала, не обработанный сывороткой. В том случае, если произойдет нейтрализация экзотоксина антитоксической сыво­роткой, животные опытной группы останутся живыми. Контрольные животные погибнут в результате действия экзотоксина.

36 Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка.

Компоненты. Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавливают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Адсорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.

Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью.

Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии нагруженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.

Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

37 Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным.

Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и AT соответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.

Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.

В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.

Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.

38 Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических Аг с помощью Ат, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими анти телами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

39Иммуноферментный анализ или метод — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (1010-1012 г/л).

Твердофазный ИФА — вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

I. При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр. сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест - конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис­пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

40 Реакция Кумбса.

Принцип.

При наличии неполных (блокирующих) антител на поверхности эритроцитов исследуемого пациента происходит агглютинация эритроцитов при инкубации их с антиглрбулиновой сывороткой (прямой тест Кумбса) или с разведениями сыворотки пациента в реакции с предварительно сенсибилизированными эритроцитами донора (непрямой тест).

Посуда.

Пробирки химические.

Пастеровские пипетки.

Мелкие белые тарелочки.

Реактивы.

Раствор 5 % цитрата натрия.

0,9 % раствор хлорида натрия.

Антиглобулинювая сыворотка (сыворотка . Кумбса) с титром преципитинов не ниже 1:256— 1:512.

НАЗАД ВВЕРХ

Прямая реакция Кумбса.

Ход определения.

3 мл крови берут из локтевой вены исследуемого в одну пробирку с предварительно внесенным 1 мл 5 % раствора цитрата натрий. Эритроциты трижды отмывают в большом объеме изотонического раствора «атрия хлорида путем центрифугирования при 1500 об/мин, в течение 10 мин. Из отмытых эритроцитов готовят 5 % взвесь на изотоническом растворе (1 капля отмытых эритроцитов и 19 капель изотонического раствора). На сухую частую белую тарелку наносяткапяю антиглобулнновой сыворотки, к ней .добавляют каплю 5 % взвеси эритроцитов исследуемого. Сыворотку перемешивают с эритроцитами стеклянной палочкой. Рядом ставят, контроль, используя вместо сыворотки изотонический раствор. Каждую новую серию антиглобулиновой сыворотки ставят аналогичным путем со стандартными сенсибилизированными эритроцитами и с интактными донорскими эритроцитами различной группы. Перемешанные эритроциты с сывороткой слегка покачивают не более 10 мин.

Учет реакции.

Появление агглютинации указывает на наличие неполных антител на поверхности эритроцитов. Реакция может быть проведена в пробирках. В этом случае 2 капли (0,1 мл) различного разведения антиглобулиновои сыворотки (в зависимости, от титра преципитинов) помещают в пробирки и добавляют каплю отмытых эритроцитов. Осторожно встряхивают и инкубируют 30 мин при 37 °С.

Учет реакции проводят после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 1 мин (центрифуга ЦЛК-1).

НАЗАД ВВЕРХ

Непрямая реакция Кумбса.

Ход определения.

Из локтевой вены исследуемого берут 3 мл крови в чистую сухую пробирку.

Реакция идет в два этапа:

сенсибилизация стандартных эритроцитов неполными антителами, предположительно находящимися в исследуемой сыворотке;

агглютинация сенсибилизированных эритроцитов антиглобулиновои сывороткой.

Необходимо использовать троекратно отмытую в изотоническом растворе смесь эритроцитов различных аллотипов 0(I) группы резусположительных. Каплю этих эритроцитов вносят в пробирку и на них наслаивают 3 капли исследуемой сыворотки. Пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 40 мин. Параллельно опыту ставят контрольные пробы. Первая: в пробирку с 2 каплями стандартных отмытых резусположительных эритроцитов 0(1) группы вносят 3 капли антирезусной сыворотки АВ (IV); вторая: в пробирку с 2 каплями отмытых стандартных резусотрицательных эритроцитов 0(1) вносят 3 капли сыворотки AB(IV). Контрольные пробирки помещают, так же как и опытные, в термостат при 37 °С на 40 мин.

После термостатирования из пробирок осторожно отсасывают сыворотку. Эритроциты трижды отмывают в изотоническом растворе натрия хлорида. На сухую чистую тарелку наносят в 3 точках по 1 капле антиглобулиновои сыворотки. В первую каплю добавляют эритроциты, сенсибилизированные сывороткой пациента, во вторую и третью — эритроциты контроля 0(I) резусположительных с антирезусной сывороткой AB(IV) и 0(I) резусотрицательные с антирезусной сывороткой AB(IV). Эритроциты тщательно перемешивают стеклянной палочкой с антиглобулиновои сывороткой. После этого осторожно покачивают тарелку в течение 10 мин, но не более.

Учет реакции.

При наличии в сыворотке пациента неполных антител в опытной смеси будет наблюдаться агглютинация. Контроль с резусположительными 0(I) эритроцитами должен дать агглютинацию. В контроле с резусотрицательными 0(I) эритроцитами агглютинации не должно быть. В ряде случаев неполные антитела вступают в реакцию при низкой температуре (4 °С), о чем необходимо помнить в исследованиях при подозрении на холодовую иммунную цитопению.

Клиническое значение.

Выявление антител к эритроцитам играет ведущую роль в диагностике аутоиммунных гемолитических анемий, эссенциальных или вторичных.

При системных заболеваниях (системная красная волчанка, хронический активный гепатит, болезнь Шегрена) бывает чаще положительной непрямая реакция Кумбса.