3. Метод определения азотосодержащих небелковых соединений

Ход работы. Прежде чем определить содержание небелкового азота в полученном фильтратеI, необходимо осадить трихлоруксусной кислотой белковые вещества. (Трихлоруксусная кислота осаждает белковые соединения, а небелковые азотистые соединения остаются в растворе). Для этого отмеривают в мерную колбу на 100 мл (или химический стакан) пипеткой 50 мл полученного фильтрата I, затем добавляют 15 мл 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и до метки 35 мл дистиллированной воды. Перемешивают и оставляют содержимое на 20-30 мин для осаждения белков, несколько раз перемешивая. Смесь фильтруют через сухой бумажный фильтр. Прозрачный фильтрат II анализируют на содержание растворимых небелковых азотистых веществ. 10 мл фильтрата II соответствует навеске 0,1 г сыра.

В колбу Кьельдаля емкостью 250 мл отмеривают пипеткой 10 мл приготовленного раствора. В эту же колбу осторожно по стенке вливают 10 мл концентрированной серной кислоты и добавляют 10-20 мг селенового катализатора. В горлышко колбы вставляют небольшую воронку или стеклянную грушу. В вытяжном шкафу вначале при слабом нагревании на асбестовой сетке, а потом при более сильном кипячении содержимое колбы доводят до полного растворения.

После сжигания отгонку аммиака проводят на приборе Сереньева.

Общее количество растворимого небелкового азота рассчитывают по формуле (4).

4. Метод определения аминного азота (пептиды, аминокислоты, амиды, аммиак)

Ход работы. В цилиндр на 50 мл отмеривают 20 мл безбелкового фильтрата водной вытяжки сыра, полученного после осаждения белков трихлоруксусной кислотой (фильтрат II). Затем добавляют 1 каплю 0,2%-ного раствора метилового красного, 4 мл 8%-ного водного раствора едкого натра и постепенно 0,1н раствора едкого натра до появления слабо-оранжевого окрашивания (рН 5,5-5,8).

В смесь вносят 0,3 г хлористого натрия и добавляют 20%-ный раствор танина до полного осаждения полипептидов (2 мл). Доводят объем до 50 мл дистиллированной водой, оставляют на 20-30 мин. После фильтрования через сухой фильтр получают прозрачный фильтрат, в котором определяют содержание азота. На сжигание берут 20 мл фильтрата, что соответствует 0,1 г сыра, и анализируют его, как и при определении растворимого белкового и небелкового азота. После проведения процесса минерализации определяют аминный азот на приборе Сереньева.

Количество аминного азота рассчитывают по формуле (4).

Материалы и реактивы:сыр; концентрированная серная кислота; селеновый катализатор (см. приложение Б, п.8); 1%-ный раствор лимоннокислого натрия; 0,1н, 0,02н растворы Н₂SО₄; 0,1н, 8% и 40%-ные растворыNаОН; смешанный индикатор (см. приложение Б, п.7); 50%-ный раствор ТХУ (трихлоруксусная кислота); 0,2%-ный раствор метиленового красного (см. приложение Б, п.9); 20%-ный раствор танина; хлористый натрий.

Оборудование: колбы Кьельдаля на 250 мл; прибор Сереньева; пипетки на 5, 10, 20 мл; цилиндры на 5, 10, 50 мл; мерные колбы на 100, 250 мл; нагревательные плитки; аналитические весы; фарфоровые ступки; складчатые бумажные фильтры.

3. Определение белка в молоке по Лоури

Принцип методаоснован на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10 – 100 мкг белка в пробе).

Ход работы.1мл молока вносят в литровую колбу и доводят до 1 л дистиллированной водой. После тщательного перемешивания в пробирку отбирают 2 мл разбавленного молока, добавляют 5 мл реактива С, после чего содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем приливают 0,5 мл реактива Фолина и колориметрируют после 45 минутной выдержки при= 750нм (красный светофильтр). Концентрацию белка молока (D_оп) в пробе находят по предварительно построенной калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой.10 мл приготовленного 0,1%-ного раствора белка казеина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Из полученного таким образом раствора в 7 пробирок отбирают порции, содержащие от 20 до 150казеина (1мг = 1000). Раствор казеина и воду вносят в количествах, указанных в таблице 6. Параллельно готовят контрольную пробу, для этого в пробирку вносят 2 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку (в том числе и в контрольную) добавляют 5 мл реактива С, после чего содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем приливают 0,5 мл реактива Фолина и колориметрируют после 45 минутной выдержки при= 750нм (красный светофильтр), концентрацию белка в пробе откладывают на оси абсцисс, по оси ординат – величину оптической плотности (D_ср) при 750нм (рисунок 4).

D_ср

D_оп

20 40 60 80 100 120 140 С10^-6, г/мл

Рисунок 4 График зависимости оптической плотности (D) от концентрации белка в пробе (С)

Концентрацию белка в молоке рассчитывают по формуле

, (5)

где К – концентрация белка в молоке, %;

с - концентрация казеина в пробе, найденная по графику, г/мл;

0,002054 – количество молока в пробе (в 2 мл, взятых для анализа), г.

Таблица 3 Основные параметры опыта и его результаты

 казеина	20	40	60	80	100	120	140
Кол-во 0,1%-ного раствора казеина, мл	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	1,4
Кол-во Н2О, мл	1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	0,6
Концентрация казеина, г/мл	2010^-6	4010^-6	6010^-6	8010^-6	10010^-6	12010^-6	14010^-6
Оптическая плотность D1
D2
Dср

Материалы и реактивы:молоко; 0,1% раствор белка казеина по Гаммарстену на фосфатном буфере (см. приложение Б п.10); реактив А (см. приложение Б п.11); реактив В (см. приложение Б п.12); реактив С (см. приложение Б п.13); реактив Фолина ( (см. приложение Б п.14).

Оборудование:пробирки; мерные колбы на 1 л, 100 мл; пипетки на 1 и 2 мл с ценой деления 0,05 мл; ФЭК-56М.

Контрольные вопросы

1. Химизм метода Кьельдаля.

2. Коэффициенты пересчета азота на белок.

3. Методика работы на аппарате Сереньева.

4. Схема определения азотосодержащих соединений в сыре.

5. Принцип метода определения белка по методу Лоури.

6. Методика построения калибровочной кривой.